1. INSTRUMENTALNE METODE ANALITIČKE KEMIJE

2. SADRŽAJ 1. Uvod Tipovi instrumenata za analizu Komponente instrumenta
Kalibracija
Značajke mjerenja
Odnos signal-šum
2. Atomska spektroskopija
Atomska apsorpcijska spektroskopija
Atomska fluorescencijska spektroskopija
Atomska emisijska spektrometrija
Optička emisijska spektrometrija s induktivno spregnutom plazmom
3. Molekulska spektroskopija
UV-Vis apsorpcijska spektrometrija
Infracrvena spektrometrija
Ramanova spektroskopija

3. SADRŽAJ 4. Elektroanalitičke metode Potenciometrija Kulometrija
Elektrogravimetrija
Voltametrija
5. Kromatografske metode
Principi kromatografije
Plinska kromatografija
Tekućinska kromatografija

4. SEMINARSKI RAD Naslov (HR):
Određivanje nekih organskih kloro-kiselina atomskom apsorpcijskom spektrometrijom (AAS) nakon ekstrakcije njihovih ionskih asocijata sa dipiridilobakrom(II) ili fenantrolinobakrom(II) kompleksom
Title (EN):
Determination of Some Organic Chloro Acids by Atomic Absorption Spectrometry (AAS) after Extraction of Their Ion-Associates with the Dipyridylocopper(II) or Phenanthrolinocopper(II) Complex (Maja Barešić)
Authors: V. Stužka, Z. Ševčikova
Journal data: Chem. Papers 50 (1996)
Struktura izlaganja seminarskog rada:
Sažetak
Uvod
Eksperimentalni dio
Rezultati i rasprava
Zaključci
Reference (navesti najvažnije, na koje se referent poziva)
Ime i prezime: Maja Barešić
Naziv kolegija: Instrumentalne metode analitičke kemije
Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku
Odjel za kemiju
Datum:

5. 5. KROMATOGRAFSKE METODE

6. Kromatografiju je izumio ruski botaničar Tswett (Cvet) početkom 20. st.
Primijenio je kromatografsku tehniku za odjeljivanje otopine biljnih pigmenata klorofila i ksantofila prolaskom kroz staklenu kolonu napunjenu usitnjenim Ca-karbonatom.
Odjeljeni sastojci vide se na koloni kao obojene vrpce po kojima je ta tehnika dobila ime (grč. Chroma = boja)
Odjel za kemiju

7. Invention of Chromatography by M. Tswett
Ether
Chromatography
Colors
Chlorophyll
CaCO3
The Russian-Polish botanist M. Tswett is generally recognized as the first person to establish the principles of chromatography.
In a paper he presented in 1906, Tswett described how he filled a glass tube with chalk powder (CaCO3) and, by allowing an ether solution of chlorophyll to flow through the chalk, separated the chlorophyll into layers of different colors. He called this technique “chromatography”.

9. KROMATOGRAFSKE METODE
Definicija i osnovni pojmovi
Kromatografija je fizikalna metoda koja se koristi za razdvajanje smjesa kojom se sastojci koji se razdvajaju raspodjeljuju između dvije faze:
nepokretne ili stacionarne faze (stationary phase, adsorbent, SP),
pokretne ili mobilne faze (mobile phase, eluent, MP), koja se kreće kroz
stacionarnu fazu u određenom smjeru.
Kromatografski proces odvija se zbog razlika između konstanti raspodjele (distribution constant) pojedinih komponenata uzorka.
Mobilna faza: solvent koji teče preko nosača (supporting medium)
plinovita: plinska kromatografija (gas chromatography, GC),
tekuća: tekućinska kromatografija (liquid chromatography, LC)
Stacionarna faza: sloj ili prevlaka (coating) na nosaču koji stupa u interakciju s analitom
kruta, tekuća (vezana na čvrstom nosaču), gel
Nosač (supporting medium): kruta površina na kojoj je vezana ili prevučena stacionarna faza

10. KROMATOGRAFSKE METODE
Definicija i osnovni pojmovi
Kromatografska kolona: cijev koja sadrži stacionarnu fazu i kroz koju prolazi mobilna faza.
Kromatograf: uređaj za izvođenje kromatografskih razdvajanja
Kromatogram: grafički prikaz odziva detektora (kromatografske analize)

11. Definicija i osnovni pojmovi
Analiti koji stupaju u jaču interakciju sa stacionarnom fazom trebat će više vremena da prođu kroz sustav nego oni sa slabijom interakcijom.
Ove interakcije su obično kemijske prirode, ali u nekim slučajevima koriste se i fizikalne interakcije.
Chromatogram

12. PODJELA KROMATOGRAFSKIH METODA
Plošna kromatografija
Stacionarna faza nanesena je na ravnu plohu ili u pore papira. Mobilna faza prolazi kroz stacionarnu fazu zbog kapilarnih sila ili gravitacije.
Kromatografija na stupcu
Stacionarna faza ispunjava usku cijev kroz koju se mobilna faza kreće pod utjecajem tlaka ili gravitacije.

13. PODJELA PREMA AGREGATNOM STANJU FAZA:
stacionarna faza
mobilna faza
krutina
tekućina
tekućina (tanki film otapala na tankom krutom poroznom nosaču
plin
mobilna faza
stacionarna faza
postupak
tekućina (liquid, l)
krutina (solid, s)
LSC
LLC
plin (gas, g)
GSC
GLC

14. PODJELA PREMA FIZIKALNO – KEMIJSKIM SVOJSTVIMA ANALITA
svojstvo analita
mobilna faza: plin
(plinska kromatografija)
mobilna faza: tekućina
(tekućinska kromatografija)
vrelište
Sve vrste GC _
adsorpcija
GSC
LSC
topljivost
GLC
LLC
oblik molekule
GSC s molek. sitima
gelna kromatografija
afinitetna kromatografija
reverzibilna kemijska reakcija
GLC uz tvorbu kompleksa
kromatografija ionske izmjene

15. PODJELA PREMA IZVEDBENIM TEHNIKAMA:
Kromatografija na papiru PC
Kolonska kromatografija CC
Plinska kromatografija GC
Tankoslojna kromatografija
TLC
Tekućinska kromatografija visoke razlučivosti
HPLC
Odjel za kemiju

16. Kromatografska analiza:
1. Unošenje (injektiranje) analita
unošenje uzorka u mobilnu fazu
2. Razdvajanje analita u koloni
sastojci iz analita razdvajaju se u koloni na temelju različite raspodjele između dviju faza.
3. Eluiranje (ispiranje) komponenti iz kolone
Ispiranje sastojaka koji prolaze kroz kolonu dodavanjem novih količina otapala.
Ako je stacionarna faza polarna onda se za mobilnu fazu uzima nepolarna.
Različiti sastojci izlaze iz kolone u različitim vremenima.
4. Detekcija
eluirane komponente obično se analiziraju mjerenjem neke od fizikalnih svojstava komponente (indeks refrakcije, UV apsorpcija, električna vodljivost …)

17. Raspodjela analita između faza
Analit se nalazi u ravnoteži između dvije faze:
Amobile ⇋ Astationary
Konstanta ravnoteže K te reakcije zove se koeficijent raspodjele:
cS … molarna analitička koncentracija sastojka u stacionarnoj fazi,
cM … molarna analitička koncentracija sastojka u mobilnoj fazi.
Odjel za kemiju

18. Vrijeme zadržavanja (retencijsko vrijeme, retention time) tR
- vrijeme potrebno da analit nakon unošenja uzorka stigne u detektor
Mrtvo vrijeme tM
- vrijeme potrebno da mobilna faza prođe kroz kolonu
Odjel za kemiju

19. ..... Faktor kapaciteta (faktor zadržavanja)
(retention factor, capacity factor)
za k'A znatno manje od 1  eluiranje je prebrzo, tR teško mjerljivo,
za k'A >  eluiranje je predugo,
k'A 1 – 5  idealno
Odjel za kemiju

20. Teorijski tavan (The Theoretical Plate)
Teorijski tavan (Theoretical plate) je pojam koji su uveli Martin & Synge. Temelji se na studiji u kojoj su oni zamislili da su kromatografske kolone analogne destilacijskim kolonama i načinjene su od brojnih diskretnih ali povezanih uskih slojeva ili tavana. Kretanje analita (solute) duž kolone može se tada tretirati kao postepeni transfer.
Teorijski tavani (N) mjere koliko efikasno kolona može razdvojiti jednu smjesu na sastavne komponente. Ta efikasnost temelji se na retencijskom vremenu komponenata i širini pikova. pp

21. Broj teorijskih tavana (Number of Theoretical Plates (N))
H = visina teorijskog tavana (Theoretical Plate Height)
L = duljina kolone.
N = L / H
HETP = Visina ekvivalentna teorijskom tavanu (Height Equivalent to a Theoretical Plate)
Kad HETP opada, efikasnost kolone raste.

22. N = Broj teorijskih tavana (mjerilo je efikasnosti)tR wb
tR je retencijsko vrijeme; mjeri se od pika injektiranja (ili nule) do sjecišta tangenti.
wb je širina baze trokuta; mjeri se na cjecištu tangenti sa baznom linijom.

23. tR tR wb wb
Veći N
Manji N
Ako se retencijsko vrijeme, tR, drži konstantnim, kolona koja daje pikove s užom bazom, wb, bit će efikasnija – ima veću N vrijednost.
Slično kolona koja daje šire pikove bit će manje efikasna – ima manju N vrijednost.

24. KROMATOGRAFIJA NA PAPIRU (PC)

25. KROMATOGRAFIJA NA PAPIRU (PC)
Opći postupak
1- Izbor papira i otapala koje će se koristiti.
2- Uklanjanje soli, makromolekula i sl. (Desalting) iz uzorka.
3- Nanošenje uzorka.
4- Uravnoteženje papira (Equilibration of paper).
5- Razvijanje (Development).
6- Detekcija.
7- Identifikacija supstanci.

26. KROMATOGRAFIJA NA PAPIRU (PC)
Primjena PC:
identifikacija supstancija,
ispitivanje čistoće supstancija.
Osobine PC:
relativno brza metoda,
potrebna mala količina materijala.
stacionarna faza: visokokvalitetni filter papir
mobilna faza: otopina razvijača
Odjel za kemiju

27. KROMATOGRAFIJA NA PAPIRU (PC)
Odjel za kemiju

30. Odjel za kemiju

31. Odjel za kemiju

32. TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA (TLC)
E. Stahl - začetnik tankoslojne kromatografije (TLC), 1950
Isti je pricip kao kod papirne kromatografije.
Odjel za kemiju

33. KROMATOGRAFIJA NA PAPIRU (PC)
Odjel za kemiju

36. Odjel za kemiju

37. Odjel za kemiju

38. Odjel za kemiju

39. PLINSKA KROMATOGRAFIJA (GC)
Martin i James – začetnici plinske kromatografije (GC), 1952.
(Nobelova nagrada)
Mobilna faza: - inertni plin koji eluira komponente smjese u koloni
napunjenoj stacionarnom fazom.
- Za razliku od tekućinske kromatografije u plinskoj kromatografiji analit ne
reagira s mobilnom fazom te zbog toga njegova brzina kretanja kroz
kolonu ne ovisi o kemijskoj strukturi mobilne faze.
Stacionarna faza:
- za odjeljivanje komponenti male molekulske mase:
stacionarna faza je čvrsta tvar velike specifične površine na koju se
adsorbiraju analizirane komponente,
- za odjeljivanje komponenti velike molekulske mase:
stacionarna faza je tekuća faza nanesena na površinu čvrstog nosača
adsorpcijom ili kemijskim vezanjem.
Odjel za kemiju

40. Analit:
ubrizgava se kao tekućina koja zbog visoke temperature u kromatografu prelazi u plinovito stanje,
temperatura ulaza instrumenta postavlja se na 50°C višu temperaturu od temperature vrelišta najslabije hlapljive komponente iz analizirane smjese.
Crvene molekule su topivije u tekućoj fazi (ili su manje hlapive) nego zelene molekule.
Odjel za kemiju

41. Obrada podataka
Ulaz za injektiranje
Peć
Detektor
Kolona
Boca sa plinom nosiocem

43. Plinska kromatografija
Odjel za kemiju

44. Plinski kromatograf Sastavni dijelovi aparata:
Plin nosilac (carrier gas):
kemijski inertan (N2 He, Ar, H2)
regulirani protok plina
Sustav za unošenje uzorka:
količina uzorka: 0.1 – 20 μL
mjesto unošenja uzorka je grijano (ca. 50°C iznad temp. vrelišta najmanje hlapljivog sastojka)
Odjel za kemiju

45. Faze plinsko-kromatografske analize:
unošenje uzorka na vrh kolone,
transport uzorka mobilnom fazom kroz kolonu,
adsorpcija sastojaka u stacionarnoj fazi,
detekcija sastojaka.
Odjel za kemiju

46. Tekuća faza Niska hlapivost Visoka točka ključanja Kemijski inertna
Primjeri:
1-squalene
Tetrahydroxyethylenediamine
Carbowax (polyethylene glycol)

47. Načini razdvajanja Izotermno (GC) Temperaturni program (GC)
Za separaciju poznatih komponenata iz smjese
Temperaturni program (GC)
Podizanje temperature kolone (GC)
Skraćuje vrijeme zadržavanja (retention time)
Oštriji pikovi
Separacija različitih komponenata različite veličine molekule

48. Injektori Najuobičajeniji su sa septumom.
Sastoji se od staklene cijevi u kojoj isparava uzorak.
Uzorak se unosi u injektor preko samozaptivnog septuma od silikonske gume.
Plin-nosilac struji kroz injektor i nosi isparene analite.
Temperatura injektora je tako podešena da se analiti trenutno ispare; mora biti barem 50° C iznad temperature ključanja najteže hlapive komponente.

49. Injektori Injekcijska šprica Septum Plin nosilac Komora za isparavanje
Na kolonu
Septum

52. Kolone i peći Kolona je srce kromatografske tehnike.
Može biti punjena ili kapilarna (open tubular).
Najuobičajenije su punjene, ali kapilarne su efikasnije i omogućavaju brža razdvajanja.
Punjene kolone su do 2 m dužine, a kapilarne od 30 do 100 m.
Punjene kolone su napravljene od čelika ili stakla, kapilarne obično od taljenog kvarca (fused silica).
Temperatura kolone se obično može programirati u cilju boljeg razdvajanja i ista je kao i temperatura peći koja okružuje kolonu.
Temperatura peći treba biti stabilna i lako promjenjiva u cilju dobijanja reproducibilnijih rezultata.

53. Kolone za GC i Stacionarne faze
Punjene kolone (Packed Columns)
Materijal kolone: najčešće nehrđajući čelik, staklo, bakar i sl.
Unutarnji promjer: mm
Punjenje: fino usitnjeni materijal ( µm promjera), prevučen stacionarnom fazom

55. Kapilarne kolone (Capillary/Open Tubular)
Nalaze široku primjenu; postoje 2 tipa.
Kolone sa prevlakom na stijenci (Wall-coated open tubular, WCOT) <1 µm debljina tekuće prevlake unutar kolone.
Kolone s prevlakom na nosaču (Support-coated open tubular, SCOT), 30 µm premaz na tekućem nosaču unutar kolone.
Vanjska površina kvarcne kolone prevučena je poliimidnim filmom u cilju povećanja njene čvrstoće.
Najčešći unutarnji promjer: µm.

58. Odjel za kemiju

60. Prednosti kapilarnih kolona u odnosu na punjene kolone
Viša rezolucija
Kraće vrijeme analize
Veća osjetljivost
Nedostatci kapilarnih kolona u odnosu na punjene kolone
Manji kapacitet uzorka
Potrebno veće iskustvo u radu

61. Materijali čvrstog nosača (Solid Support Materials)
Čvrsti nosač idealno bi trebao imati sljedeća svojstva:
Velika specifična površina (barem 1 m2/g),
Dobra mehanička stabilnost,
Termička stabilnost,
Inertna površina zbog jednostavnijeg retencijskog ponašanja i sprječavanja adsorpcije analita,
Veličina čestica: µm.

62. Izbor stacionarnih faza
Nisko hlapive tekućine,
Dobre apsolutne i diferencijalne topivosti za analite,
Termička stabilnost (zbog reproducibilnih rezultata),
Nehlapive tekućine osiguravaju minimalno curenje stacionarne faze,
Debljina filma utječe na retencijski karakter kolone i kapacitet uzorka,
Deblji filmovi se koriste kod visoko hlapivih analita, jer takav film zadržava analit duže vrijeme i osigurava dulje vrijeme za razdvajanje,
Tanji filmovi su pogodni za razdvajanje niske hlapivosti,
Debljina filma: 0.1 – 5 µm.

63. Tekuće stacionarne faze (Liquid Stationary Phases)
Polarnost stacionarne faze treba biti usuglašena s konstituentima uzorka (”slično” otapa „slično”).
Većina stacionarnih faza bazirana je na polidimetilsiloksanu ili polietilen glikolu:

65. Tekuće stacionarne faze trebaju imati sljedeće karakteristike:
Polarnost stacionarne faze može se mijenjati derivatizacijom s različitim funkcionalnim grupama, kao npr. fenilnom.
Curenje (bleeding) kolone sprječava se vezivanjem stacionarne faze na kolonu; ili umrežavanjem stacionarne faze.
Tekuće stacionarne faze trebaju imati sljedeće karakteristike:
• Niska hlapivost,
• Termička stabilnost,
• Kemijska inertnost,
• Kemijski vezana na nosač (zbog sprječavanja curenja).

66. Vezane i umrežene stacionarne faze (Bonded and Crosslinked Stationary Phases)
Svrha vezanja i umrežavanja: sprječavanje curenja i osiguranje stabilne stacionarne faze.
Pri visokim temperaturama stacionarne faze koje nisu kemijski vezane ili umrežene postepeno cure tijekom eluiranja.
Umrežavanje se izvodi na licu mjesta nakon što je kolona prevučena jednim od polimera.

68. Programiranje temperature (Temperature Programming)
Temperatura kolone mijenja se prema prethodno zadanom programu.
Programiranjem temperature dobivaju se izuzetno kvalitetni kromatogrami u najkraćem mogućem vremenu.

69. Isothermal at 45°
Isothermal at 145°
Programmed 30 to 180°

72. DETEKTORI
Detektor kontrolira plin nosilac pri napuštanju kolone i generira signal koji odgovara promjenama njegovog sastava uzrokovanog eluiranjem komponenata.
Zahtjevi koji se postavljaju pred detektore:
brzi odziv,
visoka osjetljivost,
linearni odziv,
dobra stabilnost,
jednostavnost rukovanja,
uniformni odziv prema širokom spektru kemijskih vrsta

73. a. Detektor na principu toplotne provodljivosti (Thermal Conductivity Detector, TCD)
Nedestruktivni detektor (služi za separaciju i prikupljanje čistih komponenata za dalja ispitivanja),
Srce detektora: grijano vlakno hlađeno s He (plin nosilac),
Razdvojene komponente, zbog različite toplotne provodljivosti, mijenjaju temperaturu vlakna,
Promjena temperature funkcija je koncentracije pojedine vrste,
Detektor je jednostavan, nedestruktivan, univerzalan, ne previše osjetljiv, osjetljiv na promjene protoka.

74. a. Detektor na principu toplotne provodljivosti (Thermal Conductivity Detector, TCD)

75. b) Plameno ionizacijski detektor (Flame Ionisation Detector, FID)
Efluent s kolone mješa se s vodikom i zrakom i spaljuje.
Organski sastojci sagorijevaju u plamenu stvarajući ione i elektrone koji mogu provoditi elektricitet kroz plamen. Na vrh plamenika dovodi se visoki električni potencijal, a iznad plamena postavljena je kolektorska elektroda. Mjeri se električna struja izazvana pirolizom organskih sastojaka.
Odjel za kemiju

76. b) Plameno ionizacijski detektor (Flame Ionisation Detector, FID)
Jedan od najosjetljivijih (10-13 g/s) i najpouzdanijih detektora,
Maseno-osjetljivi detektor,
Široko dinamičko područje (107),
Destruktivni detektor,
Gorivo: obično H2,
Oksidans: O2 ili zrak,
Slabo osjetljiv na karbonilnu, amino, alkoholnu grupu,
Neosjetljiv na nesagorive specije – H2O, CO2, SO2, NOx.

77. b) Plameno ionizacijski detektor (Flame Ionisation Detector, FID)

78. c) Detektor s hvatanjem elektrona (Electron Capture Detector, ECD)
Osjetljiv (10-15 g/s) na halogene (pa se primjenjuje za detekciju pesticida, polikloriranih bifenila i sl.),
Mehanizam odziva: elektronegativni atomi, kao halogeni, hvataju elektrone iz b - emitera (obično 63Ni) i smanjuju struju, koja je mjerilo koncentracije halogena,
Jednostavan i pouzdan,
Uglavnom nedestruktivan,
Ograničeno dinamičko područje (102),
Maseno-osjetljiv detektor,
Neosjetljiv na amine, alkohole i ugljikovodike.

79. c) Detektor s hvatanjem elektrona (Electron Capture Detector, ECD)

80. c) Detektor s hvatanjem elektrona (Electron Capture Detector, ECD)

81. TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE DJELOTVORNOSTI (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)
Odjel za kemiju

82. (termostatirana komora za kolonu)
TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE DJELOTVORNOSTI (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)
Detektor
Kolona
Pumpa
Peć kolone
(termostatirana komora za kolonu)
Eluent
(mobilna faza)
Unošenje uzorka
(injektor)
Otpad
A high performance liquid chromatograph differs from a column chromatograph in that it is subject to the following performance requirements.
Solvent Delivery Pump
A solvent delivery pump that can maintain a constant, non-pulsating flow of solvent at a high pressure against the resistance of the column is required.
Sample Injection Unit
There is a high level of pressure between the pump and the column; a device that can inject specific amounts of sample under such conditions is required.
Column
The technology for filling the column evenly with refined packing material is required. Also, a material that can withstand high pressures, such as stainless steel, is required for the housing.
Detector
Higher degrees of separation have increased the need for high-sensitivity detection, and levels of sensitivity and stability that can respond to this need are required in the detector.
Obrada podataka
Otplinjač (Degasser)

83. TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE DJELOTVORNOSTI (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)
RegulatorGradijenta •
Kolona
Detektor
Pumpa
Injektor
Mobilna faza
Mobile Phases - Component solvents/mobile phases to make up gradient
Gradient Controller - Sets up gradient - linearity, steps, ramps, number of solvents/mobile phases (binary, ternary, quaternary).
Pump - Dual piston, Pulse free, Able to deliver 4000PSI, Precision flow rates of 0.001mL/min, Flow range mL/min.
Injector - How do you inject a sample in to a flowing sream at 4000PSI? If you tried you’d have the syringe plunger go thru a wall! The sample injector utilizes a set of valves in which a sample loop switchs in-and-out the flowing stream. You introduce the sample by injecting it into the sample loop which has a fixed volume. The fixed volume injected replaces the contents of the loop so therefore for manual injection you should have enough injected to completely replace the previous loop contents. The sample is automatically introduced into the flowing stream by valve switching.

84. HPLC tR to Kromatogram Injektiranje
mAU
vrijeme
to – mrtvo vrijeme (elution time of unretained peak)
tR- retencijsko vrijeme – određuje identitet uzorka
Površina ili visina srazmjerna
je količini analita.

85. Mobilna faza: tekućina Stacionarna faza: punila vrlo finih zrna
Tlak: nekoliko milijuna Pa (do 4 x 107 Pa = 400 bara)
- tlačna pumpa, sisaljka
Podjela HPLC (High Performance Liquid Chromatography):
(1) Razdjelna kromatografija
(2) Adsorpcijska kromatografija
(3) Ionsko-izmjenjivačka kromatografija
(4) Kromatografija isključenjem na osnovi veličine čestica
(size-exclusion chromatography)
Doseg HPLC: najveći u separacijskim tehnikama,
proizvodnja > mld USD godišnje
Odjel za kemiju

86. Mobilna faza
tekuća
može se mijenjati sastav u cilju optimiranja separacije
može se mijenjati polarnost i pH
Osnovna svojstva
čista
kompatibilna sa detektorom
otapa uzorak
niska viskoznost
kemijski inertna

87. potiskuje mobilnu fazu kroz kolonu pod visokim tlakom
Pumpa
potiskuje mobilnu fazu kroz kolonu pod visokim tlakom
brzina protoka: 0.01 – 10 mL/min
tlak: 1 – 5,000 psi

88. Stacionarna faza - Kolona
kemijske osobine površine punjenja određuju tip interakcija koje će se događati
normalna faza (normal phase) = polarna
obrnuta (reverse) faza = nepolarna
kationski izmjenjivači
anionski izmjenjivači

89. Razdvajanje (Separation)
temelji se na interakciji između punjenja kolone i mobilne faze
HPLC normalnih faza (normal phase HPLC )
Stacionarna faza = polarna, Mobilna faza = nepolarna
HPLC obrnutih faza (reverse phase HPLC)
Stacionarna faza = nepolarna, Mobilna faza = polarna
Razdvajanje može biti:
Izokratsko (Isocratic)
isti pH
primjenjiva za razdvajanje i kvantifikaciju poznatog analita
Gradijentno (Gradient)
promjenjiv pH
primjenjiva za razdvajanje velikog broja analita – screening

90. Eluiranje Brzo eluiranje u nekoliko minuta za sve komponente u smjesi
Zadržavanje (Retention) i eluiranje analita (solutes) u LC ovisi o interakcijama analita i sa mobilnom i sa stacionarnom fazom.
- Ovisno kako se analiti zadržavaju na koloni sa različitim otapalima, uvodi se pojam slabe mobilne faze (weak mobile phase) i jake mobilne faze (strong mobile phase).
Jaka mobilna faza: otapalo koje brzo eluira analite s kolone (tj. mali k’)
To se događa kad je mobilna faza vrlo slična stacionarnoj fazi u svojim intermolekularnim interakcijama s analitima
- polarno otapalo bit će jaka mobilna faza za kolonu koja sadrži polarnu stacionarnu fazu
Brzo eluiranje u nekoliko minuta za sve komponente u smjesi

91. Eluiranje
Slaba mobilna faza: otapalo koje sporo eluira analite iz kolone (i.e., veliko zadržavanje analita ili veliki k’)
To se događa kad je mobilna faza jako različita od stacionarne faze u svojim intermolekularnim interakcijama s analitima
- nepolarno otapalo je slaba mobilna faza za kolonu koja sadrži polarnu stacionarnu fazu
Napomena: da li je otapalo slaba ili jaka mobilna faza, ovisi o stacionarnoj fazi koja se
koristi. Heksan je slaba mobilna faza na polarnoj stacionarnoj fazi, ali je jaka
mobilna faza na nepolarnoj stacionarnoj fazi.
Slow elution (~ 20 minutes) for all compounds in the mixture

92. Eluiranje ‚ jednostavno, jeftino
Slično GC, analiti se mogu eluirati s kolone koristeći konstantne uvjete kolone ili gradijentnim eluiranjem
Izokratsko eluiranje: primjena konstantnog sastava mobilne faze za eluiranje analita
‚ jednostavno, jeftino
‚ teško za eluiranje svih analita sa dobrom rezolucijom u razumnom
vremenu  opći problem eluiranja
Potrebno je pronaći takav sastav otapala da se dobije optimalno razdvajanje.
Journal of Chromatography A, 1109 (2006)

93. Eluiranje
Slično GC, analiti se mogu eluirati s kolone koristeći konstantne uvjete kolone ili gradijentnim eluiranjem.
Gradijentno eluiranje: promjena sastava mobilne faze s vremenom  programiranje otapala
‚ idući od slabe mobilne faze ka jakoj
‚ slaba mobilna faza  otapalo A
‚ jaka mobilna faza  otapalo B
‚ promjena otapala može ići postepeno, linearno ili nelinearno

94. Prednosti HPLC: - osjetljivost, - prilagodljivost,
- analiza neisparljivih i termički osjetljivih spojeva,
- široki spektar uzoraka (industrija, znanost: aminokiseline,
nukleinske kiseline, šećeri, lijekovi, pesticidi, organometalni
spojevi, anorganske tvari i dr.).
Odjel za kemiju

95. Odjel za kemiju

96. DETEKTORI • Ključni su dio HPLC-uređaja: stalno se usavršavaju
• Nema opće primjenljivih detektora (kao FID/TCD)
• Zahtjevi: kao kod GC; dodatno: što manji volumen uzorka
• Tipovi: (1) prate promjenu svojstava mobilne faze
(indeks loma, dielektrična konstanta i dr.),
(2) detektori analita (UV, fluorescencija...).
• Zastupljenost: 71% UV, 15% fluorescencijski, 5% indeks loma
Odjel za kemiju

97. DETEKTORI - Detektori indeksa loma (Refractive Index Detector)
- Detektor električne vodljivosti (Conductivity Detector)
- Detektor UV/Vis zračenja (UV/Vis Absorbance Detector)
- Elektrokemijski detektor (Electrochemical Detector)
- Fluorescencijski detektor (Fluorescence Detector)
Kao i kod GC, izbor detektora ovisi o analitu i načinu korištenja LC metode (npr. analitička ili preparativna kolona).
Detektor
Selektivnost
Osjetljivost
Napomene
Indeks loma
Slaba
Može se detektirati bilo koja komponenta koja se razlikuje u indeksu loma od eluata, usprkos njegovoj niskoj osjetljivosti . Ne može se koristiti za gradijentnu analizu.
UV/Vis
Umjerena
Dobra
Može se detektirati mnoštvo supstanci koje apsorbiraju svjetlo između 190 i 900 nm. Osjetljivost strogo ovisi o prirodi supstance.
Fluorescencija
Izvrsna
Mogu se, s velikom osjetljivosti, selektivno detektirati komponente koje emitiraju fluorescenciju. Često se koristi za pretkolonsku ili postkolonsku derivatizaciju.
Vodljivost
Detektiraju se komponente koje ioniziraju. Taj se detektor koristi uglavnom za ionsku kromatografiju.
Elektrokemijski
Mjere se struje koje nastaju redox-reakcijama. Elektroaktivne komponente detektiraju se s visokom osjetljiosti.

98. 1.) Detektor indeksa loma (Refractive Index Detector (RI))
Mjeri sposobnost mobilne faze i analita da lome ili savijaju svjetlost.
‚ jedan od nekoliko univerzalnih detektora za LC
prednosti:
– nedestruktivan i univerzalan detektor
‚ primjenjiv za detekciju bilo kojeg analita u LC
– primjenjiv za preliminarna LC ispitivanja kad su priroda i osobine analita
nepoznati
‚ uvjet je da je koncentracija dovoljno velika za detekciju
nedostatci:
– visoke granice detekcije (10-6 do 10-5 M)
– teško se može koristiti kod gradijentnog eluiranja

99. 1.) Detektor indeksa loma (Refractive Index Detector (RI))
Postupak:
– svjetlo iz izvora prolazi kroz protočne ćelije kroz koje prolazi ili struja uzorka ili referentnog sustava
– ako je indeks loma isti u obje ćelije, nema savijanja (bending) svjetla koje se događa na međupovršini (interface) između protočnih ćelija
- maksimalna količina svjetla dolazi na detektor
– kad se analit eluira, indeks loma mijenja se između referentne ćelije i ćelije uzorka
- svjetlo se savija kad prolazi kroz međupovršinu protočnih ćelija količina svjetla koja dolazi na detektor se smanjuje

100. 2.) Detektor UV/Vis zračenja (UV/Vis Absorbance Detector)
Mjeri sposobnost analita da apsorbira svjetlo na određenoj/im valnoj/im duljini/ama u UV i vidljivom području zračenja.
‚ najčešći tip LC detektora
Tri najčešća tipa detektora UV/Vis zračenja:
- Detektori fiksne valne duljine (Fixed wavelength detectors)
- Detektori promjenjive valne duljine (Variable wavelength detectors)
- Detektori s nizom fotodioda (Photodiode array detectors)

101. 2.) Detektor UV/Vis zračenja (UV/Vis Absorbance Detector)
Fixed Wavelength Detector mjeri apsorbanciju na samo jednoj valnoj duljini (obično 254 nm).
- najjednostavniji i najjeftiniji od UV/Vis detektora
- ograničena fleksibilnost
- ograničen broj supstanci koje se mogu mjeriti
Variable Wavelength Detector mjeri se na samo jednoj valnoj duljini u bilo kojem trenutku, ali se može odabrati bilo koja valna duljina u širokom spektralnom području.
‚ valne duljine od nm
‚ skuplji je, zahtijeva napredniju i kompliciraniju optiku
‚ univerzalniji je, može se koristiti za široki spektar supstanci
Photo Diode Array Detector istovremeno mjeri apsorbanciju analita na više valnih duljina.
- koristi seriju ili niz različitih detektorskih ćelija u instrumentu, svaka odgovara na promjene apsorbancije na različitim valnim duljinama.
- može snimiti kompletan spektar supstance u vrlo kratkom vremenu
- koristi se pri detekciji prisustva slabo razlučenih (resolved) pikova ili pikova kontaminanata

102. 2.) Detektor UV/Vis zračenja (UV/Vis Absorbance Detector)
Primjene:
- UV/Vis absorbance detektori mogu se koristiti za detekciju bilo koje supstance koja apsorbira na valnoj duljini pri kojoj se mjeri detekcija
- Uobičajene valne duljine:
‚ 254 nm za nezasićene organske spojeve
‚ 260 nm za nukleinske kiseline
‚ 280 ili 215 nm za proteine ili peptide
- UV-Vis absorbance detektori mogu se koristiti pri gradijentnom eluiranju
‚ valna duljina mjerenja mora biti izvan područja na kojem apsorbiraju otapala koja se koriste kao mobilna faza
- granice detekcije za detektore fiksne ili promjenjive valne duljine su ~ 10-8 M
- granice detekcije za detektore s nizom fotodioda su ~ 10-7 M

103. 3.) Fluorescencijski detektor (Fluorescence Detector)
Selektivni detektor koji mjeri sposobnost analita da fluorescira u zadanom setu ekscitacijskih ili emisijskih valnih duljina

104. 3.) Fluorescencijski detektor (Fluorescence Detector)
Primjene:
- Fluorescencija se može koristiti za selektivnu detekciju bilo koje supstance koja apsorbira ili emitira svjetlo pri odabranom setu ekscitacijskih ili emisijskih valnih duljina Relativno malo supstanci podliježu fluorescenciji
- visoka selektivnost, nizak signal šuma (background signal)
- granice detekcije fluorescentnog detektora su ~ M
- Tipične primjene:
- lijekovi,
- aditivi za hranu,
- zagađivači okoliša,
- bilo koja supstanca koja se može prevesti u fluorescirajući derivat:
alkoholi, amini, aminokiseline i proteini.
- Može se koristiti i pri gradijentnom eluiranju
- zahtjeva ekstremno čiste mobilne faze,
- tragovi nečistoća mogu utjecati na signal šuma ili gasiti (quench)
fluorescenciju analita.

105. 4.) Detektor električne vodljivosti (Conductivity Detector)
Koristi se u analitičkoj primjeni kromatografije ionskom izmjenom (ion-exchange chromatography) za detekciju ionskih spojeva
‚ detektor mjeri sposobnost mobilne faze da provodi struju u protočnoj ćeliji između dvije elektrode
‚ struja koja prolazi kroz ćeliju ovisi o broju i tipu iona prisutnih u mobilnoj fazi
Dvije elektrode smještene u mobilnu fazu, svaka odgovara jednom kraku (arm) Wheatstone-ovog mosta
Tipičan Wheatstone-ov most
Kada ioni prolaze kroz senzorsku ćeliju, impedancija između elektroda se mijenja dajući signal koji mijenja ravnotežu mosta (“out of balance” signal).

106. 4.) Detektor električne vodljivosti (Conductivity Detector)
Primjene:
- može se koristiti za detekciju bilo koje supstance koja je ionska ili slabo
ionska
- visoka selektivnost, nizak signal šuma (background signal)
- granice detekcije su ~ 10-6 M
- Tipične primjene
- zagađivači hrane
- industrijski uzorci
- uzorci iz okoliša
- Može se koristiti pri gradijentnom eluiranju
- konstantna ionska jakost i pH mobilne faze
- vodljivost šuma (background conductance) mobilne faze je
dovoljno niska

107. 5.) Elektrokemijski detektor (Electrochemical Detector)
Koristi se za mjerenje svake supstance u mobilnoj fazi koja podliježe oksidaciji ili redukciji.
- elektrokemijska detekcija u LC često se označava LC/EC
- generalno uključuje 2 ili više elektroda koje prate struju nastalu oksidacijom ili redukcijom eluiranih supstanci pri konstantnom potencijalu
- generalno, električni izlazni signal je protok (struja) elektrona nastao reakcijom koja se odvija na površini elektroda.
Protok kroz kolonu

108. 5.) Elektrokemijski detektor (Electrochemical Detector)
Primjene:
- može se koristiti za detekciju bilo kojeg analita koji podliježe oksidaciji ili redukciji
‚ detektori mogu biti napravljeni da budu specifičnu za dati spoj ili klasu
spojeva definiranim izborom uvjeta (stanja) elektrode
‚ visoka selektivnost, nizak signal šuma
- granice detekcije su ~ M
‚ zbog ekstremne točnosti kojom se kemijska mjerenja, posebice
mjerenja struje mogu izvesti
- spojevi koji se mogu detektirati redukcijom:
‚ aldehidi
‚ ketoni
‚ esteri
‚ nezasićeni spojevi
- spojevi koji se mogu detektirati oksidacijom:
‚ fenoli
‚ merkaptani (RSH)
‚ aromatski amini
‚ dihidroksi spojevi

109. 6.) Maseno-spektrometrijski detektor (Mass Spectrometry Detector)
Vrlo moćan detektor
Može biti spregnut sa GC (GC/MS) ili HPLC (HPLC/MS ili LC/MS)
Zahtijeva vrlo visok vakuum (10-5 Torr)

110. 6.) Maseno-spektrometrijski detektor (Mass Spectrometry Detector)
Koristi razliku u odnosu masa – naboj (mass-to-charge ratio (m/z)) ioniziranih atoma ili molekula za razdvajanje jednih od drugih.
Primjenjiv za kvantitativnu analizu.
Koristan za dobijanje kemijskih i strukturnih informacija.
Komponente MS detektora
Sučelje instrumenta (Instrument interface)
Ionizacijski izvor (Ionization source)
Separator masa (Mass separator)
Detektor iona (Ion detector)

111. KVALITATIVNA ANALIZA Retencijski podaci (Retention Data)
Karakteristika analita
Ovisi o interakciji mobilne i stacionarne faze
Informacije detektora
GC/MS ili LC/MS kompletan snimak (Full scan), LC-UV/VIS spektar, UV spektar
Usporedba s poznatim standardima

112. Vrijeme zadržavanja (retencijsko vrijeme, tR )
Vrijeme između injektiranja uzorka i trenutka kad analit dospije na detektor
na kraju kolone
Različiti analiti imaju različita retencijska vremena
Usporedba s poznatim standardom

113. KVANTITATIVNA ANALIZA
- Na temelju informacije o piku (odzivu detektora)
- Pretpostavka da je odziv u korelaciji s količinom analita
- Visina pika (Peak height) – jednostavno i brzo izračunavanje
- Površina pika (Peak area) – zahtjeva obradu podataka, ručnu ili automatsku
Kromatogram: signal koji daje eluirana komponenta prisutna u mobilnoj fazi, prikazan u funkciji vremena
KVANTITATIVNA
Pik
Bazna linija Rt
KVALITATIVNA

114. KVANTITATIVNA ANALIZA
Postupak
Priprema serije standarda = supstanca koja predstavlja analit u uzorku (X)
Poznate koncentracije standarda
Koncentracije koje pokrivaju područje u kojem se nalazi koncentracija analita
Ekstrakcija i izolacija pod istim uslovima kao i uzorak
Provedba kromatografske separacije pod istim uvjetima, istovremeno
Konstrukcija grafa: odziv (signal) standarda vs. koncentracija standarda

115. KVANTITATIVNA ANALIZA
Metoda Internog Standarda (Internal Standard Method)
Prirediti seriju standarda poznatih koncentracija
Dodati jednaku količinu internog standarda u svaki standard i nepoznati uzorak
Konstruirati graf: odnos odziva (Int. Std/Std) vs. odnos koncentracija (Int. Std/Std)
Konc. X = odnos koncentracija (iz grafa) x konc. internog standarda
Interni standard:
stabilan
mjerljiv
ne smije interferirati, ni kemijski ni po Rt
kemijski sličan analitu
koncentracija slična nepoznatoj koncentraciji u
uzorku

116. HPLC Applications Bioscience Chemical Pharmaceuticals
Environmental
Pharmaceuticals
Consumer Products
Clinical
polystyrenes
dyes
phthalates
tetracyclines
corticosteroids
antidepressants
barbiturates
amino acids
vitamins
homocysteine
Bioscience
proteins
peptides
nucleotides
lipids
antioxidants
sugars
polyaromatic hydrocarbons
Inorganic ions
herbicides