1. کارگاه میکروب شناسی سیستم ادراری
بسم الله الرحمن الرحیم
کارگاه میکروب شناسی سیستم ادراری

2. کشت ادراربه منظور تشخيص عفونت مجاري ادراري دربيماران مبتلا به ديزوري، تكرار يا اضطرار در دفع ادرار، همچنين در موارد تب با منشا ناشناخته و يا احتمال عفونت در تجزيه ادرار ضرورت مي يابد عوامل تداخل كننده در کشت ادرار:
آلودگي ادرار با مدفوع، ترشحات واژن، دست ها يا لباس ها، استفاده از آنتي بيوتيك ها

3. جمع آوری نمونه ادرار برای انجام کشت میکروبی
روش نمونه گيري:
متداولترین نمونه ،ادرار وسط تمیز گرفته شده می باشد.جهت احتراز از آلودگی نحوه جمع آوری حائز اهمییت می باشد. در مورد زنان باید آموزش لازم در خصوص تمیز کردن نواحی اطراف منفذ پیشابراه با استفاده از یک قطعه گاز تمیز آغشته با سرم فیزیولوزی استریل داده شود از هیچ گونه محلول ضدعفونی کننده ای نباید استفاده شود زیرا این محلولها می توانند به نمونه ادرار راه یافته و سبب ایجاد کشت منفی گردند . ( ابتدا منفذ ادرار بايد به طور دقيق با محلول يددار جهت كاهش آلودگي نمونه شستشو داده شود. ظرف ادرار استريل را به نحو صحيح در محل مناسب قرار داده، مقداري ادرار را دور ريخته و سي سي ادرار از ادرار وسط را تهيه نمايند، درپوش ظرف را ببندند.) نباید اجازه داد نمونه ادرار در بخش یا توالت به مدت طولانی باقی بماند .این موضوع باعث تکثیر ارگانیسم های موجود در ادرار گردد زیرا ادرار یک محط مناسب برای رشد آنهاست. هیچ نمونه ای غیر از نمونه آسپیره شده ناحیح فوق عانه از مثانه برای بررسی عفونت ادراری با عوامل بی هوازی مناسب نخواهد بود.

4. - در صورتي كه نمونه در منزل تهيه مي شود حداكثر طي 20 دقيقه پس از جمع آوري ادرار بايد آنرا در يخچال قرار داده، نمونه ادرار را مي توان تا ساعت پس از جمع آوري در يخچال نگه داري كرد. در زمان انتقال نمونه به آزمايشگاه آن را در كنار يخ قرار دهند.
- در مورد بيماراني كه قادر به دفع ادرار نمي باشند مي توان از سند ادراري استفاده كرد.
نمونه هاي اطفال و كودكان كم سن را در كيسه هاي يكبار مصرف به نام كيسهU چمع آوري مي كنند.اين كيسه ها داراي چسبي در اطراف پشت منفذ مي باشد كه به پوست پوبيك كودك مي چسبد. منفذ پيشابراه را پيش از چسباندن كيسه ها بايد تميز نمايند. حتي المقدور صبح اول وقت كيسه را به شيرخوار وصل كرده و تا ظهر ادرار جمع شده ارسال گردد.

5. معیار های نپذیرفتن نمونه ها ی ادرار
1-نمونه آسپیره شده برای بیهوازی نباید به داخل لوله ویا ظرف تخلیه شود زیرا تمام عوامل بی هوازی در مواجهه با اکسژن هوا کشته می شوند نمونه هایی که در ظرف اشتباه فرستاده شده ویا برچسب اشتباه دارند 3-نمونه هایی که در ظروف نشت دار ویا ظروف مقوایی گرفته می شوند.

6. · نمونه ادرار 24 ساعته:
طيف گسترده اي از بيماري ها بويژه بيماري هاي آندوكرين توسط نمونه ادرار 24 ساعته قابل تشخيص اند.
روش جمع آوري نمونه:
اولين ادرار را انجام داده و آنرا دور بريزند و زمان دقيق را يادداشت كنند (مثلا ساعت 7 صبح)، به مدت يك شبانه روز (24 ساعت)، يعني تا ساعت 7 صبح فردا تمامي نوبت هاي دفع ادرار بايد در ظرف مخصوص جمع آوري شده، در جاي خنك ترجيحا يخچال نگه داري و پس از اتمام كار به آزمايشگاه ارسال كنند

7. نحوه انجام کشت ادرار
نمونه ادرار نباید سانتریفوژ شود و قبل از برداشت با لوپ باید کاملاٌ یکنواخت گردد از لوپ کالیبره شده استفاده شود ، لوپ را بصورت عمودی در ظرف ادرار فرو برده وبصورت یک خط در وسط محیط کشت نهاده و سپس همانند شکل آن را پخش می نماییم . معمولاٌ از لوپ استفاده می شود به جز در سندرم حاد یوترال خانم ها و نمونه سوپر ایوبیک که لوپ بکار می رود. توجه :برای هر یک از محیط ها یکبار لوپ را داخل ادرار نموده وپس از انجام کشت روی شعله استریل نموده وبرای محیط دیگر مجدداٌ عمل کشت را از ابتدا انجام دهید.

9. عوامل بیماریزای احتمالی در ادرار
الف-باکتری های گرم منفی : اشریشیاکولی،کلبسیلا،آنتروباکترها،پروتئوس،سودوموناسها، سالمونلاپاراتایفی و نایسریا گونوره. ب- باکتریهای گرم مثبت: انتروکوکوس،استاف اپیدرمیدیس،استاف ساپروفیتیکوس، استاف ارئوس و استرپتوکوکهای همولیتیک

10. تعیین تعداد باکتری
تعداد کلونی ایجاد شده در محیط بلاد آگار را بعد از 24 ساعت شمارش نموده در ضریب حجم لوپ ضرب می نماییم

11. تهیه گسترش ورنگ آمیزی باکتری
اولین اقدام جهت شناسایی باکتری تهیه ی گسترش و رنگ آمیزی می باشد. بدین منظور ابتدا یک قطره سرم فیزیولوژی استریل بر روی لام (مرکز لام ) قرار داده سپس با یک آنس استریل یک قسمت کوچک از کلونی مورد نظر را برداشته در قطره سرم فیزیولوژی حل نموده بصورت شیرابه در سطح لام به اندازه وضخامت مناسب پخش می نماییم. پس از خشک شدن با کمک حرارت ملایم شعله فیکس نموده ولام آماده برای رنگ آمیزی می باشد.

12. ساخت رنگ متیلن بلو
3دهم گرم متیلن بلو رادر30 میلی لیتر اتیل الکل 95درصد بطور کامل حل نمایید پس از24ساعت این محلول راازکاغذ صافی عبور دهیدتاصاف شود

13. رنگ آمیزی متیلن بلو:
1- سطح گسترش رابه مدت 3تا4 دقیقه بارنگ بپوشانید سپس لام راباآب بپوشانید و شستشودهید.
2- پس ازخشک شدن لام (در هوایاباکاغذ خشک کن) آنرا بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار می دهیم . دراین رنگ آمیزی باکتری به رنگ آبی مشاهده می شود .

14. ساخت رنگ گرم روش ساخت کریستال ویوله
20 گرم کریستال ویوله رادر100 میلی لیتر اتانول 95 درصد حل کرده بنام محلول A
یک گرم اگزالت آمونیوم رادر100 میلی لیتر آب مقطرحل کرده بنام محلول B
محلول A رابه نسبت 1 به 10 رقیق کرده وبا 4 برابر محلول B مخلوط کرده صاف می نمایم
روش ساخت لوگول
یک گرم یدکریستال ودوگرم یدورپتاسیم راساییده ومخلوط می کنیم وسپس 300 میلی لیتر آب مقطر رابه آرامی به آن اضافه می کنیم
روش ساخت محلول بی رنگ کننده
250 میلی لیتر اتانول 95 درصد رابا250 میلی لیتر استون ترکیب کرده ودر شیشه های درب دار نگهداری می کنند .
سافرانین (رنگ مخالف)
2/5 گرم سافرانین رابا100 میلی لیتر اتانول 95 درصد مخلوط کرده ودرشیشه های درب دار نگهداری می کنند .

15. رنگ آمیزی گرم :THE GRAM STAIN
این روش رنگ آمیزی یکی از مهمترین ومتداولترین روشهای رنگ آمیزی درباکتری شناسی است که اولین بار توسط کریسین گرم ابداع شد . دراین رنگ آمیزی باکتریها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت وگرم منفی تقسیم می شوند . رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد . دررنگ آمیزی گرم باکتریهای گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می شود

16. روش رنگ آمیزی گرم
1- رنگ کریستال ویوله رابه مدت 30تا45 ثانیه برروی گسترش ریخته درنتیجه همه باکتری ها به رنگ بنفش درخواهد درآمد
2- پس از شستشو گسترش با آب به مدت 30تا45 ثانیه با لوگل می پوشانند لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس های بزرگی می نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می شود . پس ازاین مرحله نیزکماکان همه باکتریها به رنگ بنفش مشاهده می شوند .
مرحله رنگ زدایی مهمترین مرحله رنگ آمیزی است دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت 15 تا20 ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد  . درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها وغشا می گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می دهد . ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت تعداد زیاد لایه های پپتیدوگلیکان وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .
4- در انتها سطح گسترش راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت 30 تا45 ثانیه می پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار میگیرد . دراین مرحله باکتریهای بی رنگ به رنگ قرمز درمی آیند وباکتری های بنفش بدون تغییر رنگ باقی می مانند .

17. گرم منفی
گرم مثبت

20. اشکال مختلف باکتری
سه شکل معمول از باکتری ها وجود دارد: 1- کوکسی: شكل يك باكتري كوكسي شكل معمولادايره شكل است بعضي اوقات تخم مرغي يا درا ز و تقريبا نيم ميكرومتر قطر دارند  2-باسیل: به شکل میله ای 3-اسپریلیوم: به شکل فنری

21. انواع کوکسی
اسكن الكتروميكروكراف استربتوكوكوس بنومونيا

22. استربتوكوكوس
تتراد 4 كوكسي

23. اسكن الكتروميكروطراف استافيلوكك اريوس
تقسيم به صورت تصادفي توليد استافيلوكوك (خوشه انكوري) مي كند
اسكن الكتروميكروطراف استافيلوكك اريوس

24. باسیل
اسكن الكتروميكروگراف يك باسيلوس

25. استربتو باسيلوس : باسيل رشته اي
اسپیریل: به يك تا سه فرم ديده ميشود  

26. اسكن الكترون ميكروكراف ويبريو كلرا
اسكن الكترون ميكروكراف ويبريو كلرا 
ويبريو : يك اسبريل ناكامل يا كاما شكل

27. اسبريل سفت ونازك 
اسبيروكيت: اسبريل نازك وبيجيده  

28. فتوميكروگراف اسبيروكيت
اسكن الكتروميكروگراف اسبيروكيت

30. محیط های کشت مورد نیاز برای کشت ادرار
:Blood agar بلاد آگار این محیط بطور گسترده ای در باکتری شناسی پزشکی استفاده می شود ، علاوه بر اینکه یک محیط غنی شده است، یک محیط شاخص برای نشان دادن خواص همولیتیک باکتری هایی مثل استرپتوکوک پنومونیه و پیوژنز می باشد.و عموماٌ در پلیت مورد استفاده قرارمی گیرد. این محیط ، با افزودن خون استریل (ترجیحاٌ خون گوسفندی) به نوترینت آگار استریل مذاب که تا 50 درجه خنک شده باشد تهیه می گردد. غلظت خون ممکن است برای اهداف خاصی از 50-5% تغییر کند ولی معمول ترین غلظت برای کارهای روتین 10% می باشد.

31. کنترل کیفی بلاد آگار میکروارگانیسم همولیز رشد بتا + آلفا
Strep.pyogenes ATCC 19615
بتا +
Strep.pneumoniae ATCC 6305
آلفا
Staph.aureus ATCC 25923
Esch.coli ATCC 25922

32. :Chocolate agar(Heated blood agar) این محیط برای هموفیلوس انفلوانزا و دیگر ارگانیسم های سخت رشد مثل نیسریا و پنوموکوک مناسب است .در هنگام تهیه این محیط در طی حرارت دادن گلبول های قرمز پاره می شوند و مواد مغذی رها می گردند . نوترینت آگار را ذوب نموده در حرارت 75 درجه به آن خون استریل 10% اضافه نموده ، خون و آگار را با تکان دادن ملایم مخلوط کنید تا وقتی که رنگ خون قهوه ای شکلاتی شود سپس در لوله به صورت شیب دار یا در پلیت تقسیم نمایید.

33. Mueller Hinton agar مولر هینتون آگار این محیط در اصل برای جدا سازی گونه نیسریای بیماریزا تهیه شده . امروزه برای دیسک های آنتی بیوتیکی به منظور آنتی بیوگرام با تکنیک کربی – بایر به کار می رود.

34. :EMB-ائوزین متیلن بلوآگار این محیط کشت ، محیط افتراقی – انتخابی مفیدی در جداسازی وشناسایی باکتری های روده ای گرم منفی است . رنگ های ائوزین و متیلن بلو اجزائ انتخابی هستند ، در حالی که به باکتری های گرم منفی اجازه رشد می دهند، از رشد باکتری های گرم مثبت جلوگیری می کنند . قند های لاکتوز وساکاروز به محیط اضافه شده تا ایزوله را بر اساس تخمیر لاکتوز تفکیک کنند . تخمیر با تغییر رنگ و رسوب رنگ های افزوده شده در اثر افت .پی اچ مشخص و ارزیابی می شود . عمدتاٌ پاتوژن ها لاکتوز مثبت می باشند.که کلونی های آبی – سیاه با درخشندگی فلزی متمایل به سبز ایجاد می کنند (اشریشیا کلی). دیگر کلی فرم های لاکتوز مثبت مثل انتروباکتر کلونی صورتی رنگ ایجاد می کنند. کلونی های لاکنوز منفی (غیر تخمیری) شفاف بوده و کهربایی رنگ یا بی رنگ می باشند.

35. آبی –سیاه بادرخشندگی سبز فلزی
EMBکنترل کیفی
میکروارگانیسم
رشد
رنگ کلونی
E.Coli ATCC25922 +
آبی –سیاه بادرخشندگی سبز فلزی
Sal.typhimurium ATCC14028
بیرنگ تا کهربایی

36. :MacConkey Agar- محیط مک کانکی این محیط برای جداسازی باکتری های لاکتوز مثبت از لاکتوز منفی می باشد، دارای نمک های صفراوی و مقدار کمی کریستال ویوله جهت جلوگیری از رشد گرم مثبت ها است به همین جهت به آن محیطی انتخابی و افتراقی نیزمی گویند. ساکاروز ندارد معرف محیط نوترال رد می باشد لاکتوز مثبت ها قرمز یا EMB بر خلاف محیط صورتی ولاکتوز منفی ها بیرنگ می باشند . محیط افتراقی – انتخابی ضعیف ومناسب برای کشت مدفوع می باشد.M.C محیط افتراقی – انتخابی ضعیف ومناسب برای کشت ادرار می باشد.EMB

37. کنترل کیفی مک کانکی آگار
میکروارگانیسم
رشد
رنگ کلنی
E.Coli ATCC 25922 +
قرمز گل سرخی
Pro.mirabilis ATCC 12453
بیرنگ
Sal.typhimurium ATCC 14028

38. محیط های افتراقی جهت شناسایی باسیل های گرم منفی
Triple Sugar Iron Agar(TSI Agar) این محیط حاوی سه قند گلوکز،لاکتوز و ساکاروز می باشد معرف محیط فنل رد بوده وعلاوه بر آن حاوی سولفات فروز بوده که برای بررسی تولید سولفید هیدروژن استفاده می گردد. برای تفکیک باسیل های روده ای گرم منفی بر اساس تخمیر کربوهیدرات (تغییر رنگ در حضور معرف از قرمز به زرد) وتولید سولفید هیدروژن(سیاه شدن درعمق لوله) به کار میرود. غلظت گلوکز یک دهم (0.1) غلظت لاکتوز یا ساکاروز است. اگر محیط در عمق لوله زرد شود(اسیدی)، اما در سطح شیب دار قرمز شود(قلیایی) ، ارگانیسم گلوکز مثبت می باشد. رنگ زرد در سطح شیب دار و عمق نشان می دهد که ارگانیسم مورد نظر گلوکز، لاکتوز و ساکاروز مثبت می باشد. رنگ قرمز در سطح شیب دار و عمق نشان می دهد که ارگانیسم تحت بررسی یک غیر تخمیر کننده است. بعضی از میکرو ارگانیسم ها ممکن است در روی محیط کلیگلر آیرون آگار سولفید هیدروژن تولید کنند ولی در محیط سه قندی به دلیل وجود ساکاروز که در بعضی موارد مکانیسم آنزیمی تولید سولفید هیدروژن را مهار می کند ایجاد این گاز را نمی کنند مثل بعضی از سالمونلا ها و انتروباکتریاسه.

39. TSI کنترل کیفی محیط A + - K میکروارگانیسم سطح شیب دار عمق گاز SH2
E.Coli ATCC25922 A + -
Pse.aeruginosa ATCC27853 K
Sal.typhimurium ATCC14028
Shi.flexneri ATCC 12022

40. Urea agarمحیط اوره – این محیط برای جدا سازی با کتری هایی که قادربه استفاده از اوره و تولید آنزیم اوره آز می باشند به کار می رود مانند پروتئوس و به دو صورت تهیه می شوند.Urea agar Base و Urease Test Broth

41. قرمز- صورتی تند تا قرمز- ارغوانی
کنترل کیفی محیط اوره
میکرو ارگانیسم
واکنش اوره آز
تغییر رنگ
Pro.vulgaris ATCC 8427 +
قرمز- صورتی تند تا قرمز- ارغوانی
Sal.typhimurium ATCC 13311 -
بدون تغییر رنگ

42. MR-VP Broth محیط این محیط برای تفکیک باکتری ها براساس واکنش های متیل رد و وژسپروسکوئر به کار می رود . در این محیط با افزودن معرف آلفا نفتول به کشت های میکروبی که قادر به تولید محصول استوئین(استیل متیل کربینول) از تخمیر دکستروز(گلوکز) می باشند در حضور اکسیژن و قلیا اکسید می شود تا دی استیل را تولید کند که با کراتین واکنش می دهد ورنگ قرمز تولید می کند . این واکنش را وژسپروسکوئر مثبت گویند . میکروب های متیل رد مثبت ، مقادیر زیادی اسید در طی تخمیر گلوکز تولید می کنند که بر سیستم بافری فسفات غلبه کرده و به محض افزودن معرف متیل رد رنگ قرمز تولید می کند .

43. ساخت معرف آلفانفتول
:A1-محلول گرم آلفانفتول را در مقدار کمی الکل اتیلیک 95 درجه حل کرده وحجم آنرا بتدریج به 100 میلی لیتر می رسانیم .
:B2- محلول گرم هیدروکسید پتاسیم را در 100ملی لیتر آب مقطر حل می کنیم و در یخچال نگه می داریم
اضافه کرده لوله را تکان داده و 15 دقیقه B اضافه وسپس 2 قطره از معرف Aبرای تست ابتدا 6 قطره از معرف
بی حرکت قرار می دهیم پیدایش رنگ صورتی متمایل به قرمز نتیجه مثبت است .

44. ساخت معرف متیل رد
0.1 گرم متیل رد را در 300 میلی لیتر الکل اتیلیک 95 درجه حل نموده وسپس 200 میلی لیتر آب مقطر به آن اضافه می کنیم. محلول را در ظرف قهوه ای نگهداری می کنیم . پس از اضافه کردن چند قطره به محیط مورد نظر در صورت مثبت بودن قرمز رنگ می شود.

45. MR-VPکنترل کیفی میکرو ارگانیسم MR VP + - E.Coli ATCC 25922
Enterobacter aerogenes ATCC 13048

46. Sulfide Indol Motility(SIM)محیط این محیط برای جداسازی باسیل های روده ای بر اساس تولید سولفید، اندول و حرکت به کار می رود.این مشخصه ها در شناسایی انتروباکتریاسه مخصوصاٌ سالمونلا وشیگلا کمک می کند .در این محیط تیوسولفات سدیم و سولفات آمونیم فروز معرف های سولفید هیدروژن ،معرف کواکس یا ارلیخ برای اندول که در اثر استفاده از پپتون کازئین که سرشار از تریپتوفان است به وجود می آید استفاده می شود و شناسایی حرکت به علت طبیعت نیمه جامد محیط امکان پذیر است.

47. SIMکنترل کیفی میکرو ارگانیسم SH2 اندول حرکت E.Coli ATCC 25922 - +
Sal.typhimurium ATCC 13311
Shigella flexneri ATCC 9199

48. ساخت محلول کواکس یا ارلیخ
2 گرم از پودر پارا دی متیل آمینوبنزآلدئید + 190میلی لیتر اتیل الکل + 40میلی لیتر اسید کلریدریک غلیظ برای آزمایش حدود 2 میلی لیتر از محیط مورد نظر را داخل لوله ای ریخته وچند قطره از معرف کواکس به آن اضافه می کنیم در صورت مثبت بودن حلقه قرمز رنگ بین محیط ومعرف الکلی ایجاد می گردد. چنانچه نتیجه منفی بود محیط را 24 ساعت دیگر برای بررسی نگه می دارند .

49. Simmons Citrate Agarسیمون سیترات برای افتراق باکتری های گرم منفی بر اساس مصرف سیترات به کار می رود . ارگانیسم هایی که قادرند آمونیم دی هیدروژن فسفات و سیترات سدیم را به عنوان تنها منابع نیتروژن وکربن مصرف کنند به طور نسبی بر روی این محیط رشد می منند و واکنش قلیایی تولید می کنند که با تغییر رنگ معرف برم تیمول بلو از سبز(خنثی) به آبی(قلیایی) مشخص می شود.

50. کنترل کیفی سیمون سیترات
میکرو ارگانیسم
رشد
تغییر رنگ
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 +
آبی در سطح شیب دار
E.Coli ATCC 25922 -
عدم تغییر رنگ

51. + - +a -/+ (+) -a واکنش اشریشیا کلی ادوارد سیلا تاردا گونه های کلبسیلا
انتروباکتر کلوآگا
انتروباکتر آئروژنز
هافنیا آلوای
سیترو باکتر فروندی
پروتئوس ولگاریس
پروتئوس میرابیلیس
پروتئوس مورگانی
پروتئوس رتگری
حرکت + - +a
گاز(گوکز)
-/+
لاکتوز
ساکاروز
(+)
مانیتول
اندول
متیل رد -a
وژ-پروسکوئر
سیترات
اوره آز
SH2
دکربوکسیلاز لیزین

53. پیگیری کشت ادرار با توجه به تعداد کلونی
≤ Nogrowth ≤ Contamination – Possible infection ≥ Probably infection وجود یا بیشتر کلونی به ازای هر میلی لیتراز ادرار به عنوان عفونت در نظر گرفته می شود ولی در مواردی که ذکر می گردد با تعداد کلونی کمتر نیز کشت قابل بررسی است.

54. * درصورتیکه نمونه ادرار با سرنگ از مثانه آسپیره شده باشد تعداد کلونی هر چقدر باشد قابل ارزش بوده و می بایست آزمایش ادامه یابد. * اگر تعداد کلونی کمتر از باشد بررسی بیشتر لازم نیست جزء در مواردی که کلونی استاف اورئوس باشد که در این صورت تعداد هر چقدر باشد دارای ارزش بوده وپیگیری می گردد. * در خانم ها با فعالیت جنسی که سندرم حاد یوترال دارند وجود تعداد 100 کلونی به همراه پیوری به عنوان عفونت ادراری در نظر گرفته شده و روند کشت ادامه می یابد.

55. در صورت رشد چند نوع کلونی رعایت نکات زیر ضروری است
1-نوع میکروب را بر اساس اهمیت آن مشخص می کنیم با توجه به تعداد کلونی هر کدام از باکتری ها که دارای تعداد کلونی بیشتری بود گزارش می گردد (در صورتی که باکتری ها ازنظر اهمیت در یک رده باشند) رشد سه نوع ویا بیشتر کلونی بر روی محیط کشت نشانه آلودگی است.

56. ارتباط آنالیز میکروسکوپی رسوب ادرار و کشت ادرار
وکلونی ومیکروب گرم مثبت باشد ،اگر باسیل باشد فلور نرمال واگر کوکسی باشد Bac=mod وEp 10-8=WBC1-در بیماران خانم 4-3= باید نوع میکروب مشخص و آنتی بیوگرام گردد وباکتری باشد فقط شکل باکتری وازنظر گرم مثبت یا منفی بودن گزارش می گردد. EPو 10-8=WBC 2-چنانچه 2-1= باشد و باکتری کمتر از باشد آلودگی محسوب می شودEP=Many وRBC و1-0= WBC 3- چنانچه 1-0=

57. در موارد زیر دیده می شود حقیقی با کانت کمتر از 100000UTI
1-نوزادان وبچه ها 2-مردان 3-فردی که کاتتر دارد 4-کسی که جدیداٌ آنتی بیوتیک مصرف نموده است 5-مصرف بالای مایعات 6-همراه پیوری 7-انسداد ادراری 8- پیلونفریت اکتسابی ناشی از هماتوژنوس به دلیل قارچ واستاف اورئوس

58. در اوایل عفونت ادراری ممکن است گلبول سفید در ادرار نباشد ولی باکتری وجود داشته باشد در این حالت E.Coliباکتریوری بدون علامت داریم مثلاٌ در سودومونا و

59. مواردی که باکتری در ادرار نیست ولی گلبول سفید وجود دارد
1-آنتی بیوتیک مصرف شده است 2-باکتریهایی مانند بروسلا که محیط اختصاصی وزمان انکوباسیون بیشتری می خواهند ودر کشت دیده نمی شوند. 3-مصرف زیاد مایعات باعث کاهش تعداد باکتری می شود. 4- افرادی که سنگ ادراری دارند تجمع باکتری پشت سنگ ها باعث سندرم حاد مجرامی شود.

61. تشخیص افتراقی کوکسی های گرم مثبت
1- انجام تست کاتالاز : استاف ها کاتالاز مثبت و استرپ کاتالاز منفی می باشد استرپ ها از نظرهمولیز به سه دسته :آلفا ، بتا و گاما همولیز تقسیم می شوند . مهمترین استرپ ها در دسته آلفا همو لیز استرپ پنومونیه می باشد که به اپتوچین حساس است و استرپ ویریدنس که به اپتوچین مقاوم می باشد .

62. جدول تشخیص افتراقی استرپ ها
Organism
GroUp A
Group B
Group C.G
Group D enterococcus
Group D non En.
Sterpto. Viridans
Sterpto. Pneumoniae
Test
Hemolyse
بتا
بتا،هیچکدام
آلفا، بتا ، هیچکدام
آلفا ، هیچکدام
آلفا
Baciteracin S R
R . S
SXT
Optochin
Camp - +
Bile Esculin

63. استاف و میکروکوک
استاف ومیکروکوک هردو کاتالاز مثبت می باشند ولیکن میکروکوک ها به شدت کاتالاز مثبت هستند . * میکروکوک اکسیداز مثبت و استاف اکسیداز منفی می باشند.

64. ساخت معرف اکسیداز
0.1 گرم از پودر تترامتیل پارافنیل دی آمین دی هیدروکلرید میلی لیتر آب مقطر محلول تیهه شده یک هفته ماند گاری دارد.

65. تشخیص افتراقی سه جنس مهم استافیلوکوک
خصوصیات
اورئوس
اپیدرمیدیس
ساپروفتیکوس
کواگولاز + -
همولیز
+ ، -
تخمیر گلوکز در شرایط بیهوازی
حساسیت به باسیتراسین
حساس
مقاوم
حساسیت به نووبیوسین
پیگمان
زرد طلائی
سفید
خاکستری ، سفید، زرد پررنگ
تخمیر مانیتول در شرایط هوازی
متغیر
تخمیر مانیتول در شرایط بیهوازی

66. استاف اپیدرمیدیس به پلی میکسین ب مقاوم ولی ساپروفتیکوس حساس است.
استاف اپیدرمیدیس به پلی میکسین ب مقاوم ولی ساپروفتیکوس حساس است.

67. تذکر :
1- برای انجام تست کاتالاز بهتر است کلنی از روی محیط نوترینت آگار برداشته شود ولی اگر از محیط بلاد آگار استفاده می شود از سطح کلونی برداشته شود .(چون گلبول قرمز دارای آنزیم کاتالاز می باشد و نتیجه مثبت کاذب می شود.) 2-برای تست کاتالاز از آب اکسیژنه 3% استفاده می شود آنس یا ابلیکاتور مورد استفاده جهت برداشت کلونی باید از جنس غیر از فلز باشد.

69. جدول آنتی بیوتیکها
Table 2 Zone Size Interpretive Chart for Bauer-Kirby Test
R = مقاوم I = متوسط MS = نيمه حساس S = حساس

70. جدول آنتی بیوتیک ها antimicrobial agent disc code R = mm or less
I = mm
MS = mm
S = mm or more
amikacin
AN-30 15
15-16 - 16
amoxicillin/ clavulanic acid - staphylococci
AmC-30 19 20
amoxicillin/ clavulanic acid - other organisms 13
14-17 18
ampicillin - staphylococci
AM-10 28 29
ampicillin - G- enterics 11
12-13 14
carbenicillin - Enterobacteriaceae
CB-100 17
18-22 23
carbenicillin - Pseudomonas
14-16
cefazolin
CZ-30
15-17
cefotaxime
CTX-30
15-22
cefotetan
CTT-30 12
13-15
جدول آنتی بیوتیک ها

71. ceftizoxime - Pseudomonas ceftizoxime - other organisms
antimicrobial agent
disc code
R = mm or less
I = mm
MS = mm
S = mm or more
cefoxitin
FOX-30 13 -
15-17 18
ceftazidime
CAZ-30 14
ceftizoxime - Pseudomonas
ZOX-30 10 11
ceftizoxime - other organisms
15-19 20
ceftriaxone
CRO-30
14-20 21
cephalothin
CF-30
chloramphenicol
C-30 12
13-17
ciprofloxacin
CIP-5 15
16-20
clindamycin
CC-2
15-20
doxycycline
D-30
13-15 16

72. oxacillin - staphylococci
antimicrobial agent
disc code
R = mm or less
I = mm
MS = mm
S = mm or more
erythromycin
E-15 13
14-22 - 23
gentamicin
GM-10 12
13-14 15
imipenem
IPM-10
14-5 16
kanamycin
K-30
14-17 18
nalidixic acid
NA-30
14-18 19
nitrofurantoin
F/M-300 14
15-16 17
norfloxacin
NOR-10
13-16
oxacillin - staphylococci
OX-1 10
11-12
penicillin
P-10 28 29
streptomycin
S-10 11
12-14

73. sulfamethoxazole + trimethoprim
antimicrobial agent
disc code
R = mm or less
I = mm
MS = mm
S = mm or more
sulfamethoxazole + trimethoprim
SXT 10
11-15 - 16
tetracycline
Te-30 14
15-18 19
trimethoprim
TMP-5
vancomycin
Va-30 9
10-11 12
ticarcillin
TIC-75 11
12-14 15
tobramycin
NN-10
13-14

74. دیسک های آنتی بیوتیکی مورد استفاده در انواع نمونه ها بر حسب نوع باکتری
1- در مواردی که استاف از نمونه ادرار جدا گردد از دیسک های زیر استفاده می شود. آمپی سیلین –نیتروفورانتوئین- کوتریموکسازول- سفالکسین یا سفالوتین – جنتامایسین – نوروفلوکساسین – سیپروفلوکساسین تمام استاف ها به وانکومایسین وبیشتر آنها به ریفامپین حساسند.

75. 2-در مواردی که استرپ از نمونه ادرار جدا گردداز دیسک های زیر استفاده می گردد: آمپی سیلین – نیترو فورانتوئین – کوتریموکسازول – تتراسایکلین – سفالکسین یا سفالوتین – نورفلوکساسین در حال حاضر در مورد استرپ پیوژن گروه آ سویه مقاوم به پنی سیلین گزارش نشده است ولذا نیازی به آنتی بیوگرام نیست

76. E.Coli- pro.-Kle.3-درمواردی که از نمونه جدا گردد از دیسک های زیر استفاده می شود آمپی سیلین- کوتریموکسازول – نیتروفورانتوئین- سفالکسین یا سفالوتین – نالیدیکسیک اسید- تتراسایکلین- جنتامایسین- آمیکاسین- نورفلوکساسین- سفتوتاکسیم یا سفتی زوکسیم.

77. 4-در مواردی که سالمونلا از نمونه بیمار جدا گردد از دیسک های زیر استفاده می گردد: آمپی سیلین – کوتریموکسازول – کلرامفنیکل – سفوتاکسیم یا سفتی زوکسیم – سیپروفلوکساسین – جنتامایسین

78. 5- در مواردی که شیگلا از نمونه بیمار جدا گردد ازدیسک های زیر استفاده می شود: آمپی سیلین – کوتریموکسازول – تتراسایکلین – سفوتاکسیم یا سفتی زوکسیم – نالیدیکسیک اسید – نورفلوکساسین

79. 6-در مواردی که سودوموناس ودیگر باکتری های غیر تخمیری از نمونه ادرار جدا گردد از دیسک های زیر استفاده می شود: جنتامایسین – آمیکاسین – کارپنی سیلین – تیکارسیلین یا پی پیراسیلین – سفتازیدیم یا سفتی زوکسیم –نورفلوکساسین

80. آزمایشات حساسیت ضد میکروبی(آنتی بیوگرام)
به دو روش انجام می شود: 1- روش رقیق سازی که یک روش کمی و وقت گیر است و استفاده روتین ندارد :Disk Diffusion2- روش

81. Disk Diffusion
عملی ترین وساده ترین روش تعیین حساسیت داروئی باکتریها روش انتشار از دیسک می باشد در این روش میزان برداشت باکتری باید از نظر کدورت با لوله نیم مک فارلند برابر باشد ( لوله نیم مک فارلند حاوی 0.6 میلی لیتر کلرور باریم 1% که بایستی با اسید سولفوریک 1% به حجم 100 میلی لیتر رسانیده شود)محلول فوق را به میزان 6-4 میلی لیتر در لوله تقسیم کرده ودرب لوله را با درب های سر پیچ دار بسته وبدین ترتیب می توان آنها را در یخچال و در تاریکی به مدت 6 ماه نگهداری نمود.

82. با افزودن 5-4 کلونی یکسان به مقداری سرم فیزیولوژی استریل می توان کدورت معادل نیم مک فارلند را تهیه نمود.سپس یک سواپ استریل را داخل لوله نموده ومایع اضافی را با جدار لوله می گیریم ، سواپ را در جهات مختلف بر روی پلیت آگار مولر هینتون حرکت داده وحتی دور پلیت را هم آغشته می کنیم

83. حداکثر بعد از 5 دقیقه پس از تلقیح میکروب به محیط آنتی بیوگرام دیسک های آنتی بیوتیک را با فاصله ی مناسب از یکدیگر قرار می دهیم و به مدت ساعت در انکوباتور میگذاریم وبعد از آن قطر هاله عدم رشد را با خط کش اندازه گیری نموده و باجدول مقایسه نموده و بصورت حساس ، بینابین و مقاوم گزارش می کنیم

84. تذکر:
1- دیسک های آنتی بیوگرام از دور پلیت 9 میلی متر فاصله داشته باشند و فاصله بین دو دیسک حداقل 14 میلی متر باشد. 2-محیط مورد استفاده برای آنتی بیوگرام مولر هینتون با پی اچ 7/4- 7/2 و عمق محیط 4 میلی متر( در پلیت های 15 سانتی میلی لیتر و در پلیت های 10 سانتی حدود میلی لیتر محیط اضافه گردد.)جهت جلوگیری از خشک شدن محیط باید پلیت ها را در کیسه های پلاستیکی نگهداری کرد. 3-پلیت های که حاوی محیط با عمق کمتر از 4 میلی متر می باشند باعث ایجاد محدوده حساسیت بزرگتر از حد معمول می گردند ودر موارد ی که محیط ضخیم باشد فرم های مقاوم دیده می شود یعنی انتشار خوب صورت نمی گیرد.

85. 4-اگر غلظت باکتری کم باشد بیشتر نتایج را حساس گزارش می کنیم ( مقاوم را اشتباهاٌ حساس گزارش می شود) زیرا منطقه ممانعت از رشد خیلی زیاد است. اگر غلظت در کشت زیاد باشد منطقه ممانعت از رشد کم و بیشتر نتایج را مقاوم گزارش می کنیم دیسک های آنتی بیوگرام بایستی در فریزر در دمای منهای 20 درجه نگهداری گردد وقبل از استفاده حدود یک ساعت قبل در دمای محیط قرار گیرد در غیر این صورت موجب کاهش در نفوذ آنتی بیوتیک دیده می شود زمان قرار دادن دیسک ها نیز اهمیت دارد .در زمان طولانی فرصت تکثیر باکتری ها قبل از قرار دادن دیسک وجود دارد که باعث کاهش قطر منطقه می گردد.

86. 7-اگر دیسک در قسمتی از محیط افتاد آنرا همانجا قرار دهید 8-اگر پس از 24 ساعت باکتری مورد نظر روی محیط مولررشد نکرد ، باکتری گرم منفی بود روی ای ام بی و اگر گرم مثبت بود روی بلادآگار آنتی بیوگرام گردد.

87. از توجه شما متشکرم