2. كنترل كيفي آزمايشگاه ميكروب شناسي
موضوع :
كنترل كيفي آزمايشگاه ميكروب شناسي

3. تهيه و کنترل کیفیت محیط های کشت
نکات عمومی در مورد محیط های کشت:
آب:
کیفیت محیط های کشت بطور مستقیم بستگی به کیفیت مواد خام مورد استفاده در تهیه آنها دارد. آب یکی از مهمترین موادی است که در تهیه محیط های کشت بکار میرود. سه معیار مهم برای آب مورد استفاده در تهیه محیط های كشت شامل وجود یونهای مس، قدرت هدایت الکتریکی و pH می باشد. در شرایط ایده آل یونهای مس بدليل خاصیت مهارکنندگی برای اغلب میکروارگانیسم ها نباید در آب مورد استفاده جهت تهیه محیط های کشت وجود داشته باشد. قدرت هدایت الکتریکی آب باید کمتر از 15 میکرو زیمنس باشد وهمچنینpH آب مورد استفاده بهتر است کمی اسیدی باشد ولی نباید کمتر از 5/5 باشد.

4. توزين محيط کشت و افزودن آب:
طبق دستورالعمل تهيه محيط کشت که بر روي قوطي نصب گرديده است، مقدار مناسبي از پودر محيط کشت را با دقت وزن نماييد. ظرف محيط کشت را دور از کوران هوا و رطوبت باز کنيد. از استنشاق پودرها به خصوص آنهايي که داراي مواد سمي هستند و تماس طولاني مدت آنها با پوست اجتناب کنيد. پودر را به سرعت، به دقت و بدون ايجاد توده اي از غبار وزن کنيد. هرچه زودتر درب ظرف را ببنديد.
نصف حجم آب مورد نياز را داخل ظرف بريزيد. سپس مقدار وزن شده محيط کشت را به آن اضافه نماييد. براي چند دقيقه به تندي تکان دهيد. باقيمانده آب را به ديواره ظرف بريزيد تا ذرات محيط کشت چسبيده به ديواره نيز وارد محلول شوند. اين مرحله بسيار مهم است، چون پودر خشک محيط کشت در بالاي سطح آب، ممکن است در اتوکلاو استريل نشود و منبع آلودگي گردد.

5. حل کردن محيط کشت:
محيط هاي کشت بدون آگار، معمولا با تکان دادن آهسته و ملايم حل خواهند شد. اما محيط هاي کشت حاوي آگار بايد قبل از حرارت دادن به مدت چند دقيقه با آب مخلوط شوند. سپس حرارت داده شوند تا آگار قبل از اتوکلاو کردن، حل شود. محيط هاي کشت را بجوشانيد بدون آنکه بسوزند.
محيط هاي کشتي که نبايد اتوکلاو شوند، بعد از اين مقدار حرارت دادن، براي تقسيم داخل پليت ها يا ظروف ديگر آماده خواهند بود. اکثر محيط هاي کشت به استريليزاسيون نهايي (در دماي C °121 به مدت 15 دقيقه) نياز خواهند داشت.

6. اندازه گيري و تنظيم pH:
محيط هاي کشت دهيدراته اگر بطور مناسب تهيه شوند نيازي به تنظيم pH ندارند.pH نهايي محصول استريل شده را مي توان روي پليت يا بطري اندازه گيري کرد، اما بايد آنها را بعد از سنجش pH دور ريخت. بنابراين بعد از استريل شدن و خنک شدن محيط کشت تا دماي C °25، مقدار pHرا در حد مورد نظر (2/0 ±) تنظيم نماييد. تنظيم pH معمولا با استفاده از هيدروکسيد سديم 40 گرم در ليتر (تقريبا" يک مولار) و يا با استفاده از اسيد کلريدريک 5/36 گرم در ليتر (تقريبا" يک مولار) انجام مي شود.

7. توزيع:
محيط کشت را در ظرفي مناسب با حجم 2 تا 3 برابر حجم محيط کشت بريزيد تا بتوانيد آنرا به خوبي تکان دهيد و مخلوط کنيد.

8. استريليزاسيون:
بعضي از محيط هاي کشت به استريليزاسيون با اتوکلاو احتياجي نداشته و با جوشاندن استريل مي شوند که دستور ساخت آنها بر روي برچسب قوطي محيط کشت قيد گرديده است. استريليزاسيون ساير محيط هاي کشت توسط حرارت مرطوب يا صافي غشايي انجام مي گردد که اين موارد نيز بر روي بر چسب قوطي محيط کشت قيد گرديده است.

9. الف) استريليزاسيون با حرارت مرطوب:
استريليزاسيون محيط کشت تا حجم يک ليتر، در اتوکلاو به مدت 15 دقيقه و در دماي C °121 (فشار 2/1 کيلوگرم بر سانتيمترمربع) انجام مي گيرد. براي حجم هاي بيشتر از يک ليتر بايد چرخه استريليزاسيون را بطور مناسب تغيير داد. اما چون اکثر مشکلات در استريليزاسيون محيط هاي کشت وقتي رخ ميدهد که مقادير بيشتر از دو ليتر محيط کشت بايد استريل شود، لذا توصيه مي شود که مقادير زياد محيط کشت را در حجم هاي کوچکتر تقسيم نماييد.

10. کنترلی کیفی اتوکلاو
کنترل دما و فشار اتوکلاو بایستی بطور مداوم انجام گردد. برای کنترل اتوکلاو از اندیکاتورهای شیمیائی TST استفاده می کنند. از اندیکاتورهای بیولوژیکی که جهت کنترل کارائی اتوکلاو استفاده می کنند اسپور Bacillus Stearothermophilus را می توان نام برد که بصورت تجاری قابل دسترس می باشد.

11. ب) استريليزاسيون با صافي غشايي:
از صافي غشايي براي استريل کردن محيط هاي کشت و ترکيبات حساس به حرارت استفاده مي شود. استريليزاسيون بوسيله صافي غشايي تحت شرايط خلاء يا افزايش فشار انجام مي پذيرد. از غشاء ها و صافيهاي با قطر منفذ 22/0 يا 45/0 ميکرومتر استفاده نماييد. اين فيلترها بايد قبل از استفاده، در اتوکلاو استريل شوند. در مورد غشاء ها و صافيهايي که در بسته بنديهاي استريل به فروش مي رسند، به دستورالعمل سازنده مراجعه نماييد. قسمت هاي مختلف دستگاه صافي را با صافي يا بدون صافي در اتوکلاو به مدت 15 دقيقه در دماي C °121 استريل نماييد.

12. آماده سازي جهت مصرف:
بعد از استريليزاسيون، اجازه دهيد دماي محيط کشت به حدود C °50 برسد، سپس با رعايت شرايط آسپتيک در ظروف نهايي تقسيم نماييد. هيچ وقت محيط کشت را در دماي بالاتر از C °50 تقسيم نکنيد. مکمل هاي حساس به گرما و حرارت بايد بعد از اين که دماي محيط کشت به حدود C °50 رسيد، به آن اضافه شوند. اجازه دهيد دماي مکمل (ساپلمنت) استريل قبل از اين که به محيط کشت اضافه شود، به دماي اتاق برسد. سپس مکمل را با رعايت شرايط آسپتيک به محيط کشت اضافه نموده، خوب مخلوط کنيد و در ظروف نهايي که از قبل استريل شده اند، تقسيم نماييد.

13. پتری دیش:
کیفیت پتری دیش های مورد استفاده در تهیه محیط نیز اهمیت دارد. معمولاً پتری دیش ها را را با اتیلن اکساید ویا اشعه گاما استریل می کنند. در صورت استفاده از پتری دیش هایی که با اتیلن اکساید استریل شده باشند بایستی از نظر وجود بقاياي این ماده بررسی شود زیرا اتیلن اکساید دارای خاصیت مهار کنندگی برای میکروارگانیسم ها می باشد و می توان آن را با روش کروماتوگرافی اندازه گرفت. در صورت استفاده از پتری دیش های شیشه ای بایستی از پتری دیش هایي از جنس بروسيلیکات استفاده کرد. استفاده از پتری دیش هایي از جنس قلیائی ممکن است موجب آزاد سازی قلیا در داخل محیط کشت گردد.

14. پارامترهای فیزیکی:
محیط کشت های تهیه شده باید قبل از استفاده، از لحاظ فیزیکی و ظاهری نيز بررسی شوند. معیارهای ظاهری قابل بررسی شامل وجود حباب، حفره، ناصافی سطح محیط، ترک خوردگی، یخ زدگی می باشد. ضخامت محیط نیز اهمیت دارد. ضخامت محیط های کشت پلیتی نبايد كمتر از 3 میلی متر باشد.

15. روش تهيه برخي محيط هاي كشت روش تهیه محیط کشت ژلاتین (ترکیبی)
پیتون= g5
Beef Extract = g 3
ژلاتین= g 120
مقادیر فوق را به cc1000 آب‌ مقطر اضافه کرده و در بن ماری جوش قرار دهید تا کاملاً حل شوند (از حرارت دادن این محیط کشت بر روی شعله پرهیز کنید). سپس در اتوکلاو به مدت 15 دقیقه و دمای oC121 در فشار 15 پوند ( Lb15) استریل ‌نمایید. سپس در لوله تقسیم کرده و PH محیط کشت را به 8/6 برسانید

16. روش تهیه محیط کشت آب پپتونه قلیایی یا APW (ترکیبی)
پیتون= g10
کلرور سدیم (Nacl)= g10
آب‌مقطر=cc 1000
سپس pH را به 9-6/8 برسانید و در شرایط 15 دقیقه, فشار Lb 15 در اتوکلاو قرار داده و استریل نمایید. دما نیز oC121 است. ( برای تنظیم از سودN 1 استفاده کنید)

17. روش تهیه محیط کشت NaCl5/6% (براث/ آگار)
محیط پایه همان محیط برین هارت اینفیوژن براث/آگار است. از آنجا که این محیط کشت حاوی 5/0% نمک می‌باشد، بنابراین 6% نمک به این محیط پایه اضافه نمایید تا مقدار 5/6% نمک حاصل شود. شرایط استریلیزاسیون همان دمایoC121، فشار Lb15 و زمان 15 دقیقه می‌باشد.
براساس دستور ساختی که روی هر بسته محیط کشت قید شده پودر بلادآگار را وزن نموده و در مقدار مشخص آب مقطر بریزید پس از حرارت دادن و ذوب کامل پودر آن را در 121 درجه سانتیگراد برای 15 دقیقه اتوکلاو نمایئد پس از خروج از اتوکلاو و سردشدن تا دمای 500C تا 550C حدود 10 درصد خون گوسفند اضافه نماید و پس از مخلوط کردن به آرامی داخل پتری دیش ازمایشگاهی تقسیم کنید. و بگذارید سرد شود. اگر قصد ساختن آگار شکلاتی ChoColate Ajar را دارید پس از افزودن خون به بلاد آگار آن را در دمای 75 تا 80 درجه قرار دهید تا محیط آگار شکلاتی داشته باشید.

18. Mueller Hinton Agar محیط مولر هینتون آگار
این محیط کشت در اصل برای جداسازی گونه نیسریابی بیماری زا فرموله شد. امروزه بیشتر در ارتباط با دیسک‌های آنتی بیوتیکی با توان بالا برای تعیین الگوهای حساسیت آنتی بیوتیکی بکار می‌رود. روش ساخت آن بسیار ساده است پس از وزن مقدار مشخص از پودر آن را در آب مقطر استریل و در روی شعله حرارت داده تا پودر کاملاً حل شود سپس در اتوکلاو 121 درجه سانتیگراد برای 15 دقیقه استریل نمایئد پس از خروج از اتوکلاو و سرد شدن تا 50 درجه سانتیگراد آن را در ظروف پتری دیش تقسیم کنید ضخامت محیط کشت از چهار میلیمتر بیشتر نگردد.

19. محیط Macconkey Agar
این محیط برای کشت انتروباکتریاسه مفید است و محتوی نمک صفراوی است تا باکتری‌های غیر روده‌ای را مهار کند و نیز برای تشخیص کلی فرم‌های تخمیر کننده لاکتوز از سالمونلاهای غیر تخیمرکننده لاکتوز و گروه دیسانتری، حاوی لاکتوز یا قرمز خنثی (Neutra red )است.

20. Bismuth Sulfite Ajar
بیسموت سولفیت آگار مناسب برای جداسازی سالموفلاتایفی و دیگر بایسل‌های روده‌ای است روش ساخت آن مطابق دستور الصاقی روی ظرف میحط کشت است. بیسموت سولفیت آگار یک محیط کاملاً مغذی به علت وجود پپتون‌ها، عصاره گوشت گاو و دکستروز است. سولفات فروز، معرف تولید سولفیدهیدروژن است بیسموت فلز سنگینی است که خاصیت مهار کنندگی بعضی از میکرو ارگانیسم‌ها را دارد رنگ بریلیانت گرین نیز به عنوان مهار کننده است حضور این مهار کننده‌ها باعث مهار باکتر‌ی‌های گرم مثبت و بیشتر ارگانیسم‌های گرم منفی روده‌ای به جز اکثر گونه‌های سالمونلا و بعضی از گونه‌های شیگلا می‌شود. ممکن است گونه سالمونلا براساس ظاهر و رنگ کلونی احتمالی شنساسایی گردد. رنگ سیاه یا سبز ایجاد شده، یک رسوب فلزی است که وقتی سولفید هیدروژن (که توسط سالمونلا از ترکیبات سولفور در میحط ایجاد شده) با یک نمک آهن واکنش بدهد، تولید می‌شود. به طور شاخص کلونی ها سیاه یا سبز هستند و ممکن است با هاله سیاه یا قهوه‌ای تیره با درخشندگی فلزی سبز احاطه شده باشند.

21. ظاهر کلونی‌های شاخصی (Typic) و واکنش آنها روی بیسموت سولفیت آگار به شرح زیر است :
Salmonella typhi : کلونی‌های مسطح، خشک، سیاه مرمری احاطه شده با هاله‌های سیاه مایل به قهوه‌ای در محیط معمولاً درخشندگی فلزی وجود دارد.
Salmonlla typhi : کلونی‌های سیاه مرطوب، بدون هاله
S Paratyphi – S. Cholerasuis – S.gallinanum – morganella morganij کلونی‌ سبزبدون هاله
Shigella spp مهار می‌شود، اما اگر رشد کند، کلونی‌های سبز مایل به قهوه‌ای دارد این محیط کشت احتیاج به اتوکلاو ندارد.

22. محیط Cary and Blair Transport medium
این محیط برای جمع‌آوری و حمل نمونه‌های بالینی به کار می‌رود. در سال 1964 Cary and Blair فرمول جدیدی را شرح دادند که برای انتقال نمونه‌های مدفوع درست شده بود. محیط آنها حاوی مقدار ماده‌ مغذی کم، پتانسیل اکسید و احیاء پائین و PH بالا بود Cary و همکارانش روی بقاشیگلا و سالمونلا در این محیط تحقیق کردند. در بررسی 162 نمونه مدفوع، ارگانیسم های شیگلا برای 49 روز قابل جداسازی بودند سالمونلاها برای 45 روز در پی تلقیح سازی وقتی آلوده کننده‌های پروتئوسی و سودوموناسی وجود داشتند و برای 62 روز در غیاب این آلوده کننده‌ها، قابل جداسازی بودند.

23. Gaines و همکارانش یک سلسله آزمایش روی Cary and Blair Transport medium برای جمع‌آوری نمونه‌های مدفوع یا رکتال سواب در منطقه‌ای از تایلند که اسهال اندمیک بود انجام دادند آنها نتیجه‌گیری کردند که این محیط کشت روشی کارا و موثر را برای انتقال نمونه‌های مدفوع فراهم می‌کند.این محیط با حداقل مواد مغذی، فرموله شده تا بقای ارگانیسم را بدون پاسخ و دفاع افزایش دهد. تایوگلیکولات سدیم اضافه می‌شود تا پتانسیل اکسید و احیای پائینی را فراهم کند، PH نسبتاً بالا نابودی باکتری‌ها به علت تشکیل اسید را کاهش می‌دهد. سواب‌های فرو رفته در مدفوع یا نمونه‌های دیگر را داخل لوله‌های محتوی محیط ترانسپورت (انتقالی) قرار دهید. لوله‌ها در طی حمل به آزمایشگاه در دمای اتاق نگهداری می شوند به محض رسیدن لوله‌ها به آزمایشگاه باید از سواب‌های برای تلقیح محیط‌های مغذی استفاده کرد. محیط کری بلر را پس از آماده سازی تا یک سال در دمای اتاق می‌توان نگهداری کرد.

24. نگهداری محیط های کشت تهیه شده:
طول عمر محیط های کشت تهیه شده بستگی به نوع اجزاء تشکیل دهنده محیط، نحوه نگهداری و ذخيره کردن آنها دارد. تمامی محیط های کشت باید دور از نور نگهداری شوند. تابش نور به محیط های کشت موجب تشکیل مواد باکتریوستاتیک و باکتریساید مانند پراکسیداز می گردد. طول عمر اغلب محیط های کشت پلیتي در دمای 4 درجه سانتیگراد یک هفته می باشد ولی اگر در داخل کیسه های پلاستیکی بسته بندی شوند بطوریکه هوا داخل آنها نفوذ نکند تا 4-3 هفته قابل مصرف هستند. طول عمر محیط های کشت حاوی آنتی بیوتیک بستگی به پایداری آنتی بیوتیک موجود در آن دارد. در مجموع محیط های حاوی آنتی بیوتیک را در مدت یک هفته باید مصرف کرد

25. . از سوی دیگر با گذشت زمان اینگونه محیط های کشت رطوبت خود را از دست داده، بدلیل افزایش غلظت آنتی بیوتیک قدرت انتخابی آنها افزایش می یابد. پلیت ها را باید قبل از مصرف به دمای اتاق رساند. اگر پلیت محیط کشت بیش از 8 ساعت در دمای اتاق باقی بماند برای مصرف مناسب نمی باشد. محیط های کشت لوله اي در مقایسه با محیط های کشت پلیتی عمر طولانی تري دارند. اغلب این محیط های کشت اگر در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شوند 6-3 ماه قابل مصرف می باشند.

26. موارد استثناء: تايوگليكولات براث، اندول نيترات براث و SIM فقط به مدت يكماه قابل نگهداري مي باشند. محيط هاي CTA Medium و OF Medium حاوي كربوهيدرات و مولرهينتون براث فقط به مدت 6 هفته قابل نگهداري مي باشند.

28. کنترل کیفی محیط های کشت میکروبی:
اصطلاحات مربوط به سویه های میکروبی کنترل
سویه کنترل (Control Strain): میکروارگانیسمی که برای ارزیابی عملکرد میکروبی محیط کشت استفاده می شود.
سویه مرجع (Reference Strain): میکروارگانیسمی که حداقل تا سطح جنس و گونه شناسایی شده و بر اساس ویژگی ها و ترجیحاً منشا آن، فهرست بندی و تعریف شده است.
ذخیره های مرجع (Reference Stocks): کشت های بدست آمده از پاساژ سویه مرجعی که از مراکز بین المللی تهیه شده است.
ذخیره های کاری (Working Stocks): کشت مجددی که از کشت های ذخیره جهت کنترل کیفیت محیط های کشت استفاده می شود.

29. منبع سویه های کنترل:
.(American type culture collection) این سوشها، حداقل سوشهایی هستند که باید برای ارزیابی هر محیط کشت استفاده شوند. ارگانیسم های مورد استفاده برای اهداف کنترل کیفی مي تواند از سویه های National collection باشد. سویه های دیگری نیز ممکن است توسط سازنده محیط کشت به کار رود که شامل مجموعه ای از سویه های وحشی (Wild strain) یا بدست آمده از نمونه های بیمار می باشد که مختص هر آزمایشگاه بوده و برای انجام آزمایش هاي بیشتر به کار می روند.

30. روش انجام آزمون کنترل کیفیت محیط های کشت تهیه سوسپانسیون میکروبی:
یک کشت از ارگانیسم کنترل کیفی روی پلیت بلادآگار تهیه کنید. بعد از انکوباسیون پلیت 5-3 کلنی ایزوله را در مقدار کمی تریپتیکیس سوی براث (TSB) استریل حل نمایید تا سوسپانسیون میکروبی حاصل شود و آن را برای چهار یا پنج ساعت انکوبه نمایید. سپس کدورت آن را با استاندارد نیم مک فارلند تنظیم کنید. (استاندارد نیم مک فارلند در طول موج 625 nm، دارای جذب 08/0 تا 1/0 ناتومتر می باشد)

31. به جای این روش می توان مستقیماً از کلنی های ایزوله روي پليت، سوسپانسیون میکروبی مطابق با كدورت نيم مك فارلند تهيه كرد. بدين ترتيب كه 5-3 کلنی ایزوله روی پلیت 24 ساعته را در 5-3 میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل حل كرده و کدورت آن را با نیم مک فارلند تنظیم نماييد. با هر روشی که این سوسپانسیون ميكروبي تهیه شود، باید كدورتي حاوی CFU/ml کلنی داشته باشد. (مطابق با استاندارد نیم مک فارلند).

32. بررسی آزمایش هاي عملکردی محیط کشت (Performance testing)
1- آزمایش ظرفیت مغذی بودن (Nutritional activity) محیط هاي کشت پلیتی مانند بلاد آگار
سوسپانسیون اولیه را به نسبت 1 به 100 در نرمال سالین یا آب مقطر استریل رقیق نموده و مقدار lµ 10 یا ml 01/0 سوسپانسیون رقیق شده را به محیط کشت مورد آزمایش تلقیح كنيد. تعداد کلنی های مورد انتظار در هر پلیت (CFU/plate) می باشد. برای اجتناب از رشد زیاد باکتری در بعضی از محیطهای کشت انتخابی ممکن است نیاز باشد که سوسپانسیون را ده بار رقیق تر تهیه نماييد.

33. 2- آزمايش ظرفیت مهار کنندگی محیط های کشت انتخابی پليتي مانند مكانكي آگار
سوسپانسیون اولیه را به نسبت 1 به 10 در نرمال سالین یا آب مقطر استریل رقیق نموده و مقدار lµ 10 یا ml01/0 سوسپانسیون رقیق شده را به محیط کشت مورد آزمایش تلقیح کنید. تعداد کلنی های مورد انتظار در هر پلیت (CFU/plate) می باشد. برای اجتناب از رشد زیاد باکتری در بعضی از محیطهای کشت انتخابی ممکن است نیاز باشد که سوسپانسیون ده بار رقیق تر تهیه شود.

34. 3- آزمایش محیط های کشت لوله ای
هر لوله باید با lµ 10 یا ml01/0 از سوسپانسیون اولیه تهيه شده مطابق با نیم مک فارلند (بدون رقيق سازي) تلقیح شود. گاهی ممکن است به تلقیح کمتر یا بیشتر نیاز باشد.
محیط مورد آزمون را بعد از تلقیح تحت شرایطی که در جدول 2 آمده است، انکوبه نمایید. به طور نرمال زمان انکوباسیون، ساعت یا ساعت در دمای Cº 2±35 می باشد. محيط شکلات آگار و ساير محیط های کشت برای جداسازی انتخابی گونه های نیسریای بیماریزا باید در 10- 5% Co2 انکوبه شوند و در فواصل زماني24-18 ساعت وسپس ساعت بررسی گردند.
برای باكتري هاي بی هوازی، کشتها عموماً به حداقل 48 ساعت انکوباسیون در شرایط بی هوازی و غنی از Co2 نیاز دارند.
در مورد کمپیلوباکتر آگار، پلیتها باید در Cº 42 در شرایط میکروآئروفیلیک غنی از Co2 به مدت 48 ساعت انکوبه شوند.

35. 4- کنترل محیط های کشت براي آزمایشهاي بیوشیمیایی
از سوسپانسیون میکروبی رقیق نشده برای كنترل این محیطها استفاده می کنیم.
پس از تلقیح، تمام کشت ها را در شرایط لازم (از نظر Co2، رطوبت و یا شرایط بیهوازی و درجه حرارت مناسب) قرار داده و پس از طی مدت زمان لازم (24 تا 48 ساعت) آنها را مورد بررسی قرار می دهیم. محیط های مناسب دارای رشد كافي از کلنی های باکتریهاي مورد نظر مي باشند و در مورد محیطهای انتخابی مهار میکروارگانیسمهای مورد نظر بايد مشخص باشد.

36. کنترل محیط های ساخته شده تجاری (آماده مصرف):
رطوبت: محیطهای کشت باید بدون هر گونه رطوبت اضافی بوده، همچنین هیچ نشانه ای از خشک شدن اطراف محیط کشت نبايد مشاهده گردد.
سترون بودن: محیطهای کشت باید عاري ازآلودگی باشند.
رنگ: محیطهای کشت آگار خوندار نباید هیچ نشانه ای از همولیز داشته باشند و محیطهای کشت دیگر نباید هیچگونه تغییر رنگ غیر طبیعی داشته باشند.

37. بررسی آلودگی محیط های کشت (استریل بودن محیط های کشت):
بررسی آلودگی محیط های کشت (استریل بودن محیط های کشت):
در صورتیکه تعداد پلیت یا لوله تهیه شده در هر سری ساخت یا Lot، 100 عدد یا کمتر باشد، باید به تعداد 5-3% محیط هاي تهیه شده را در دماي Cº به مدت 5-2 روز انکوبه نمود. برای Lot های با تعداد بيش از 100، باید به تعداد 10 پلیت یا لوله را به طور تصادفی برداشته و در شرایط فوق انکوبه نمود. بعد از انکوباسیون هیچ گونه رشد میکروبی نباید مشاهده شود.

38. یک محیط کشت زمانی قابل قبول می باشد که با همه سویه های پیشنهادی برای آزمون محیط کشت که در جدول 2 مشخص شده است، رشد کافی داشته و خصوصیات مورفولوژیكي کلنی ها بارز باشد. در مورد محیط های انتخابی، رشد بعضی از ارگانیسم های خاص مهار می شود، ضمن اینکه اجازه رشد کافی به سايرارگانیسم می دهد. در بعضی موارد، واکنشهای رنگی خاص یا همولیز همچنانکه در جدول 2 آمده است، باید ایجاد شود. مثلاً در مورد کشت بلادآگار ایجاد همولیز مناسب ضروری است و یا برای محیط مکانکی آگار ایجاد واکنش های رنگی برای سویه های میکروبی مشخص ضروری می باشد.

39. سایر معیارهای تضمین کیفیت:
محیطهای کشت آماده مصرف باید از نظرموارد زیر نيز بررسی شوند:
شکستگی ظروف پتری
پر شدن ناصاف پلیتها
ترک خوردگی محیط کشت در پلیتها
وجود همولیز (برای بلاد آگار)
یخ زدگی
وجود مقدار زیاد حباب یا حفره در سطح محیط كشت

40. جدول 2- كنترل كيفي محيط هاي كشت متداول

42. نگهداري ديسك‌هاي آنتي بيوتيكي
ديسك‌ها بايد در دمای-8 تا -14 درجه سانتیگراد نگهداري شوند.
تمامي ديسك‌هاي آنتی‌بیوتیکی گروه بتالاكتام مانند پني‌سيلين، آمپي‌سيلين، كربني‌سيلين، تيكارسيلين، اگزاسيلين و نسل اول، دوم و سوم سفالوسپورين‌ها و... بايد در فريزر نگهداري شوند و فقط مي‌توان مقداري از آن را بر اساس كار روزانه آزمايشگاه حداكثر به مدت يك هفته در يخچال معمولی نگهداري نمود.
ديسك‌ها بايد در ظروف داراي درپوش محكم و حاوي مواد جاذب رطوبت نگهداري شوند.
ديسك‌هاي آنتي‌بيوتيكي بايد يك تا دو ساعت قبل از استفاده از يخچال يا فريزر خارج شوند تا به درجه حرارت اتاق برسند.

43. کنترل کيفيت قطر هاله عدم رشد سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي
سويه هاي کنترل کيفي  را بايد به روش استاندارد آزمايش  disk diffusionو با استفاده از همان مواد و روشي که براي سويه هاي جدا شده از نمونه هاي کلينيکي استفاده مي شود  آزمايش و نتايج را با جداول
 CLSI  مقايسه و بررسي نمود . محدوده قطر هاله عدم رشد قابل قبول براي هر سويه کنترلي نسبت به يک ديسک آنتي بيوتيکي در جداول فوق فهرست شده است .
چنانچه تغيير در ميانگين قطر هاله عدم رشد ناشي از خطا در روش انجام آزمايش نباشد ، احتمالا" ناشي از تغيير در حساسيت ذاتي باکتري نسبت به آن آنتي بيوتيک مي باشد. در اين صورت لازم است کشت تازه از سوش کنترل تهيه شود .

44. آزمايش کنترل کيفيت را بايد درچه فواصل زماني انجام داد ؟
آزمايش کنترل کيفيت  را بايد درچه فواصل زماني انجام داد ؟
الف _ انجام آزمايش روزانه     
 براي هر سويه کنترلي با يک ديسک آنتي بيوتيکي بايد 20 روز متوالي آزمايش تعيين حساسيت انجام و نتايج با مقادير قابل قبول اشاره شده در جداول فوق مقايسه گردد . بر اساس ضريب اطمينان 95% تنها يک مورد از 20 نتيجه قرائت شده مي تواند خارج از محدوده كنترل باشد ( به ضميمه 2مراجعه کنيد) . چنانچه بيشتر از يک مورد خارج از محدوده کنترل باشد نياز به اقدامات اصلاحي خواهد بود ، که در ادامه توضيح داده مي شود.

45. ب _ انجام آزمايش هفتگي
- در صورتيكه تنها يک مورد از 20 نتيجه  قطر هاله عدم رشد براي هر سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي خارج از محدوده قابل قبول مندرج در جداول 3 و A3( ضميمه 3) قرار گيرد ، کنترل کيفي روزانه را به هفتگي تغيير دهيد( به ضميمه 2 مراجعه کنيد) .
- آزمايش کنترل کيفي هفتگي را يکبار در هفته و هم چنين زمانيکه يکي از عوامل آزمايش (مانند سري ساخت آگار يا ديسکهای تهيه شده از يک سازنده) تغيير کند، انجام دهيد .
اگر هر يک از نتايج کنترل کيفي هفتگي خارج از محدوده قابل قبول باشد ، انجام اقدامات اصلاحي مورد نياز است .

46. نگهداري و استفاده از سويه‌هاي باکتريايي
براي نگهداري سويه‌هاي باکتريايي مي‌توان از دو روش استفاده نمود.
روش طولاني مدت
روش کوتاه مدت

47. نگهداري طولاني مدت
نگهداري طولاني‌مدت باکتريها اين امکان را مي‌دهد که کليه سويه‌هاي ميکروبي اعم از هوازي (بارشد سريع ويا سخت رشد) ونيز بيهوازي ، ماهها و حتي سالها به صورت زنده نگهداري شوند. بهترين روشهاي نگهداري طولاني مدت شامل ليوفيليزاسيون (Freeze drying) و نگهداري در دماي 70- درجه سانتي‌گراد يا پايين تر ( در ديپ فريز يا در نيتروژن مايع ) مي‌باشد.

48. 1- نگهداري در ديپ فريز ( 50- تا 70- درجه سانتي‌گراد يا پايينتر) ويا نيتروژن مايع :
باکتري مورد نظر را روي محيط مغذي مانند پليت TSA ( Trypticase Soy Agar ) حاوي 5% خون گوسفند و در مورد ميکروارگانيسمهاي سخت رشد روي محيط آگار شکلاته کشت دهيد. پليتها را به مدت ساعت در دماي 2±35 درجه سانتي‌گراد و در صورت نياز تحت شرايط CO2 براي هر باکتري انکوبه نمائيد.

49. بعد از انکوباسيون، خالص بودن و مورفولوژي کلني‌ها را بررسي نموده و در صورت نياز، تستهاي بيوشيميايي آنرا انجام دهيد. سپس از باکتري رشد يافته ، سوسپانسيون غليظي در ميلي‌ليتر از يک محيط محافظت‌کننده از سرما (Cryoprotective ) تهيه نمائيد. اين محيط براي جلوگيري از تخريب سلولهاي باکتري در شرايط انجماد مورد استفاده قرار مي‌گيرد. محيط محافظت‌کننده از سرما مي‌تواند Skim milk ، خون گوسفند يا خرگوش دفيبرينه استريل يا Tryptic Soy Broth (TSB) حاوي گليسرول با غلظت نهايي 15-10% باشد.
سپس از سوسپانسيون باکتريايي فوق به مقدارmL 1- 5/0 در ويالهاي شيشه‌اي يا پلاستيکي کوچک استريل توزيع کنيد . تعداد ويال ذخيره خود را براي مصرف يکسال آماده نمائيد.

50. سويه‌هاي سخت رشد مانند هموفيلوس انفلوآنزا و نيسريا گنوره در اين دما قابل نگهداري نمي‌باشند و بايد در فريزر 70- درجه نگهداري شوند.
سويه‌هاي بارشد سريع در اين دما عمر کمي دارند و تعداد زيادتري از آنها از بين مي‌روند. بنابراين توصيه مي‌شود براي اطمينان از حيات سويه‌ها هر چند ماه ، طبق روش زير کشت داده شوند.
يک ويال از فريزر بيرون آورده و و سريعا زير آب جاری ولرم محتويات آنرا ذوب نمائيد. نمونه را روي محيط آگار خوندار يا شکلاته ( در مورد باکتريهاي سخت رشد ) تلقيح کرده و به مدت ساعت در دماي 2±35 درجه ودر صورت نياز در شرايط CO2 انکوبه نماييد. اين باکتري مي‌تواند براي آزمايشهاي کنترل داخلي کيفيت در آزمايشگاه يا براي تهيه working control بکار رود. قبل از هر اقدام بايد از خالص بودن نمونه ، اطمينان حاصل کرد. ويال مورد استفاده بعد از ذوب شدن بايد دور انداخته شده و بهيچوجه مجددا فريز نگردد.

51. کشتهاي working control :
عبارتست ازکشت مجدد از کشت ذخيره فريز شده که براي کنترل کيفيت محيط کشت و.. استفاده مي‌شود.
از کشت ذخيره تا 3 پاساژ پشت سر هم مي‌توان انجام داد . پس از آن ، نمونه بايد دور انداخته شده و از يک کشت ذخيره فريز شده ديگر براي تهيه کشتهاي working control استفاده شود. پاساژهاي مکرر( بيش از 3 پاساژ)، احتمال تغيير فنوتيپي سويه‌ها را افزايش مي‌دهد.
براي تهيه working control ، از کشت ذخيره فريز شده ، روي پليت يا آگار شيبدار تلقيح و آنرا به مدت يک شبانه‌روز تا زماني که رشد مناسبي بدست آيد، انکوبه نمائيد. در مورد ارگانيسمهاي با رشد سريع اين پليت يا آگار شيبدار را مي‌توان در 8-2 درجه سانتيگراد يا در دماي اتاق تا مدت 4 هفته نگهداري نمود. بعد از هر پاساژ، خالص بودن و مورفولوژي کلني‌ها را بررسي نمائيد.

52. - استفاده از روغن معدني در دماي اتاق :
1- محيط کشت Brain Heart Infusion Agar (BHIA) را با شيب کم در لوله تهيه نماييد. براي باکتريهاي مشکل‌پسند مانند گونوکک ، مننگوکک ، استرپتوکک پنومونيه و هموفيلوس آنفلوانزا ، لازم است محيط شکلات آگار را با افزودن 5% خون گوسفند به محيط فوق پس از خروج از اتوکلاو و رسيدن به دمای 50 درجه سانتی‌گراد و قرار دادن در بن‌ماري 80 درجه سانتي‌گراد به مدت 15 دقيقه تهيه نمود.
2- روغن معدني ( يا پارافين مايع ) را در حرارت خشک ( 170 درجه سانتي‌گراد به مدت يکساعت ) استريل نمائيد.
3- ميکروب مورد نظر را روي محيط کشت دهيد.
4- بعد از بدست آوردن کشت کافي ، روغن استريل را به مقدار cc 1 روي سطح محيط بريزيد.
5- در صورت نياز به کشت مجدد ، نمونه از سطح آگار (زير روغن ) برداشته مي‌شود.
6- بعد از 12-6 ماه تجديد کشت نماييد.

53. - کشت عمقي و نگهداري در دماي اتاق :
- کشت عمقي و نگهداري در دماي اتاق :
اين روش فقط براي باکتريهايي که مشکل‌پسند نيستند مانند استافيلوکک وخانواده انتروباکترياسه بکار مي‌رود.
1- يک محيط کشت آگار بدون کربوهيدرات مانند TSA را باعمق زياد در لوله تهيه نماييد.
2- باکتري را بصورت کشت عمقي در در اين محيط تلقيح نماييد.
3- اين محيط را 24 ساعت در اتو 35 درجه انکوبه نمائيد.
4- در لوله را با درپيچ يا چوب پنبه ببنديد.
5- لوله در پيچ‌دار را در پارافين مايع فرو ببريد به گونه‌اي که کاملا در لوله را بپوشاند.
6- کشتها را در حرارت اتاق نگهداري نمائيد.
7- هرساله سوش موردنظر را تجديد نمائيد.

54. تست حساسیت:
تست حساسیت با توجه به رشد نمونه و اهمیت ارگانیسم توسط روش نیمه مک فارلند یا روش استاندارد دیسک دیفیوژن کربی‌بایر انجام می‌شود.
- نگهداري طولاني مدت
براي نگهداري سويه‌هاي باكتري مي‌توان از روش‌هاي طولاني و كوتاه مدت استفاده نمود.
بهترين روش‌هاي نگهداري طولاني مدت شامل ليوفيليزاسيون (Freeze drying) و نگهداري در دماي 70- درجه سانتيگراد يا پايين‌تر (در ديپ‌فريز يا در نيتروژن مايع) مي‌باشد.
در صورت عدم دسترسي به فريزر 70- درجه مي‌توان سويه‌هاي با رشد سريع را در فريزر 20- درجه نيز نگهداري نمود.

55. در اين شرايط توجه به نكات زير ضروري است:
سويه‌هاي سخت رشد مانند هموفيلوس آنفلوآنزا و نيسريا گنوره در اين دما قابل نگهداري نمي‌باشند و بايد در فريزر 70- درجه نگهداري شوند.
روش دیگر استفاده از روغن معدني در دماي اتاق می‌باشد که در این روش روغن معدني (يا پارافين مايع) را در حرارت خشك (170 درجه سانتيگراد به مدت يك ساعت) استريل می‌نمایند و سپس ميكروب مورد نظر را روي محيط كشت داده و بعد از بدست آوردن كشت كافي، روغن استريل را به مقدار cc 1 روي سطح محيط می‌ریزند

56. تهيه كدورت استاندارد نيم مك فارلند
هدف:
جهت استاندارد کردن غلظت تلقيح براي آزمايش تعيين حساسيت ميكروبي، بايد از استاندارد سولفات باريم (BaSo4)، برابر با استاندارد نيم مک فارلند استفاده شود.
2- مواد و ابزار لازم:
کلرور باريم دهيدراته، اسيدسولفوريک، مزور، بالن ژوژه، لوله آزمايش در پيچ دار استريل

57. - روش انجام کار:استاندارد نيم مک فارلند سولفات باريم به روش زير تهيه مي شود
1)ml 5/0 از کلرور باريم (BaCl2) mol/l 048/0 (2H2O .W/VBaCl2 175/1%) را به ml5/ 99 اسيد سولفوريکmol/l 18/0 (V/V 1%) اضافه کنيد و با هم زدن مداوم سوسپانسيون بدست آوريد.
2) چگالي صحيح کدورت استاندارد با استفاده از اندازه گيري جذب در اسپکترو فتومتر با طول مسیر نوري cm1، مشخص شود. جذب در nm625 بايد بين 08/0 تا 13/0 باشد.
3) سوسپانسيون سولفات باريم بايد به مقدار ml6-4 در لوله هاي در پيچ دار هم اندازه با لوله هاي سوسپانسيون باکتريايي ريخته شود.
4) درب اين لوله ها بايد محکم بسته شوند و در دماي اتاق و در تاريکي نگهداري گردند.
5) استاندارد سولفات باريم قبل از هر بار استفاده بايد به شدت (ترجيحا با ورتکس مکانيکی) همزده شود، تا کدورت يکنواختي ايجادگردد. در صورت مشاهده ذرات بزرگ، بايد استاندارد تازه اي تهيه گردد.
6) استاندارد سولفات باريم بايد به صورت ماهانه جايگزين شود يا جذب آن اندازه گيري گردد.

58. کنترل کیفی و کالیبراسیون لوپ میکروب شناسی
از بین وسایل مورد استفاده در بخش میکروب شناسی لوپ میکروب شناسی از جمله ابزارهای مهم و اصلی بوده و ارزش آن همانند پی پت در آزمایشگاه بیوشیمی و سرولوژی است .بدین معنی که اگر از مقدار برداشت شده توسط لوپ محاسبه دقیق به عمل نیاید در گزارش نتایج آزمایش تاثیر زیادی خواهد داشت . لذا به سبب عدم وجود روش استاندارد جهت کالیبراسیون لوپ و نظر به اهمیت آن در این مقاله سعی شده است که راه کارهای مناسب و عملی برای کالیبراسیون لوپ میکروب شناسی ارائه گردد . در بررسی انجام شده دو روش محاسبه حجم توسط روش اسپکتروفتومتری و روش استفاده از ترازو مورد ارزیابی قرار گرفته اند .

59. در اینجا حجم برداشت شده توسط دو نوع لوپ مورد مصرف که تحت عنوان لوپ های تجاری در بازار موجود بوده و به عنوان لوپ 0.01 و لوپ استفاده میشوند مورد بررسی قرار گرفت و نیز با توجه به اینکه برخی از آزمایشگاه های تشخیص پزشکی لوپ های دست ساز را که با استفاده از پیچیدن سیم به دور دسته فلزی لوپ تهیه می شوند مورد استفاده قرار می دهند این نوع لوپ ها نیز به دو روش اسپکتروفتومتری و توزین مورد ارزیابی قرار گرفتند . همچنین مقدار حجم برداشتی توسط لوپ ها به صورت تخمینی و از طریق ریاضی مورد بررسی قرار گرفت .

60. الف ) روش اسپکتروفتومتری : در این روش از یک ماده رنگی که دارای جذب نوری در طول موج خاص است استفاده می گردد . معمولا از ماده رنگی اوانس بلو برای این آزمایش استفاده میشود اما با توجه به کمبود و گران بودن ماده مزبور در این بررسی از متیلن بلو که از نظر اقتصادی به صرفه بوده و در اکثر آزمایشگاه ها موجود است استفاده شد .
مواد مصرفی و معرف ها شامل موارد زیر بود :
پودر متیلن بلو – الکل طبی 96% ( اتانول ) – آب مقطر – لوپ های 0.01 و و لوپ های دست ساز – لوله آزمایش – پی پت – سمپلر 20 لاندا – اسپکتروفتومتر

61. ابتدا 0.2 – 0.1 گرم از پودر متیلن بلو را در حلالی که از مخلوط کردن آب مقطر و الکل 96% به نسبت 50 به 50 تهیه شده حل می کنیم . پس از حل شدن کامل متیلن بلو در حلال مزبور 8 لوله آزمایش انتخاب کرده در لوله اول 2 میلی لیتر و در بقیه لوله ها 1 میلی لیتر از حلال ساخته شده را می ریزیم . سپس مقدار 0.02 میلی لیتر از محلول متیلن بلو را به کمک سمپلر کالیبره شده به محلول اضافه کرده و پس از مخلوط کردن 1 میلی لیتر از محلول مزبور را به لوله دوم انتقال می دهیم و این عمل را تا لوله هشتم پی می گیریم ( رقت های سریالی ).پس از تهیه رقت های مزبور جذب نوری هر یک از لوله ها را در طول موج 663 نانومتر قرائت کرده و ثبت می کنیم .

62. با توجه به کاهش تصاعدی رقت لوله ها از کاغذ لگاریتمی برای تهیه منحنی استاندارد استفاده میشود . پس از ترسیم منحنی برای کالیبره کردن لوپ لوله برداشته و در هر یک از آنها 1 میلی لیتر از حلالی که تهیه کرده بودیم می ریزیم و به کمک لوپ از محلول رنگی ( متیلن بلو ) در لوله ها وارد می کنیم . پس از خواندن جذب نوری آنها در طول موج 663 نانومتر و به دست آوردن میانگین جذب نوری و انتقال آن بر روی منحنی مقدار حجم برداشته شده توسط لوپ به راحتی به دست می آید .
از آنجا که مقدار کلنی بر اساس CFU/ml ( colong forming unit ) گزارش می گردد اگر 1 میلی لیتر را که برابر با 1000 لاندا می باشد بر حجم به دست آمده تقسیم کنیم ضریب لوپ مجهول به دست خواهد آمد.

63. ب ) روش توزین : در این روش ترازوی حساس با دقت 0
ب ) روش توزین : در این روش ترازوی حساس با دقت گرم مورد نیاز است و از آنجا که وزن و حجم آب مقطر خالص مساوی هستند می توان به کمک لوپ از آب مقطر برداشت کرد و بر روی یک دیسک آنتی بیوگرام قرار داد و با توزین توسط ترازو مقدار حجم برداشتی را محاسبه کرد . در این روش ابتدا دیسک آنتی بیوگرام توزین می شود سپس مقدار افزایش وزن بر اثر برداشت آب مقطر توسط لوپ محاسبه می گردد . اگر این عمل را بار تکرار کرده و میانگین افزایش وزن را ثبت کنیم حجم برداشتی توسط لوپ به دست خواهد آمد.

64. ج ) روش محاسبه ریاضی : در این روش اگر قطر سیم مورد استفاده در ساخت لوپ را توسط میکرومتر اندازه گیری کرده و قطر داخلی حلقه لوله را توسط کولیس محاسبه کنیم حجم برداشتی از طریق محاسبه حجم استوانه به دست می آید . این روش برای محاسبه مقدار برداشتی توسط لوپ چندان دقیق نیست زیرا حجم برداشتی توسط لوپ در مقایسه با روش های استاندارد حجم بیشتری را نشان می دهد و در عمل از آنجا که کشش سطحی بافت باعث می شود مقدار کمتری از محلول در مرکز لوپ قرار گیرد میزان برداشتی نهایی کمتر خواهد بود .

65. نتیجه بررسی : مقایسه نتایج حاصل از بررسی 3 روش فوق نشان می دهد که حجم برداشت شده توسط لوپ هایی که به عنوان لوپ تجاری عرضه میشوند استاندارد نیست برای مثال با لوپ تجاری مقدار برداشتی لوپ 0.6 لاندا می باشد و در مورد لوپ 0.01 مقدار برداشتی 2.4 لاندا است . در نهایت ضریب لوپ برابر با و لوپ 0.01 برابر با و لوپ دست ساز تقریبا معادل 338 است که با مقادیر ادعا شده تفاوت دارند

66. با توجه به بررسی های مزبور موارد زیر پیشنهاد میشود :
- لوپ هایی که تحت عنوان 0.01 و به صورت تجاری به فروش می رسند استاندارد نبوده و هر آزمایشگاه می باید نسبت به کالیبراسیون و تععین ضریب دقیق لوپ مصرفی اقدام کند.
2- در صورت عدم کالیبراسیون لوپ مصرفی شمارش کلنی در کشت ادرار به صورت تخمینی گزارش شود. ( کمتر از 1000 یا یا بیشتر از )
3- برای کالیبراسیون لوپ به علت مجهز نبودن اکثر آزمایشگاه ها به ترازوی حساس روش اسپکتروفتومتری پیشنهاد می شود .
4- حتی المقدور سعی گردد تا لوپ ها به صورت پلاستیکی و یک بار مصرف تهیه شود .

67. انكوباتور
انكوباتور محفظه عايق بندي شده‌اي است كه دما و رطوبت را كنترل کرده و محيط را براي رشد ميكروارگانيسم‌ها فراهم می‌سازد. برخی از انكوباتورها براي نگهداري ميزان مطلوب از دی‌اکسیدکربنCo2 براي ميكروب‌هايي كه برای رشد به CO2 نیاز دارند (Capnophilic) در دسترس هستند. -

68. انكوباتور بدون Co2:
در این انکوباتور نمونه‌ها باید بطور مناسب روي سيني‌ها يا قفسه‌ها قرارگیرد.
مي‌توان با قرار دادن يك مخزن آب در كف انكوباتور، رطوبت مورد نیاز را حفظ کرد.
- انكوباتور Co2دار:
دراین انکوباتور برای تأمین دی‌اکسید کربن مورد نیاز از کپسول گازCO2 استفاده می‌شود.
در صورت اتمام كپسول گاز Co2، تا زمان شارژ مجدد مي‌توان جهت انكوباسيون نمونه‌هاي نيازمند Co2 از جار بیهوازی یا کندل جار که از سوزاندن شمع به عنوان منبع CO2 استفاده می‌شود بصورت جايگزين استفاده کرد.

69. - مراقبت از انکوباتور:
-همه انكوباتورها بايد بطور ماهانه با محلول صابون ملايم تميز شوند. -كپسول‌هاي Co2 به منظور رعايت موارد ايمني، بايد به صورت ايستاده با زنجير سنگين به ديوار محكم شوند. -زماني كه از سيلندرها استفاده نمي‌شود، سوپاپ‌ها و درپوش‌ها بايد به طور محكم بسته شوند. سيلندرهاي خالي را روي حمل كننده سيلندر گاز به طور محكم با زنجير نگهداري كنيد. هرگز سيلندرهاي گاز را در دماي بالاتر از 52 درجه سانتیگراد یا 125 درجه فارنهایت نگهداري نكنيد. جهت جلوگیری از نشت، سيلندرها را در وضعيت افقي قرار ندهيد. -برای کنترل وضعیت CO2 انکوباتور، يك كشت از نيسريا گونوره در انكوباتور قرار دهيد، هر روز آن را پاساژ داده و رشدش را بررسي نماييد. اين ارگانيسم به Co2 نياز كامل دارد.

70. اتوكلاو
اگر چه اتو كلاو بهترين وسيله براي استريليزاسيون است، ولي طولاني شدن مرحله گرمايي، سبب كاهش كيفيت مواد مغذي در محيط‌هاي كشت كمپلكس محتوي قند، مواد معدني و فلزي مي‌شود و در نتيجه به محيط‌هاي كشت زيان وارد مي‌كند، بنابراين در چرخه‌ي استريليزاسيون بايد از زمان كوتاهتر و دماي بالاتر استفاده كنيم تا علاوه بر آنكه آسيب كمتري به محيط كشت وارد شود، براي ارگانيسم كشنده‌تر باشد.

71. - انواع استريليزاسيون استريليزاسيون محيط‌هاي كشت و محلول‌ها
استريليزاسيون مواد مصرفي آلوده
استريليزاسيون مواد خشك بسته بندي شده

72. نکات کاربردی:
بهتر است از لوله و ارلن با در پيچ‌دار شل که بيشتر از آن پرنشده است استفاده کنید.
جهت برقراری جریان مناسب سفارش می‌شود که از قرار دادن اشيا بر روي يكديگر بپرهيزيد و بايد فاصله اشيا از يكديگر و از ديواره‌هاي اتوكلاو حداقل 5 سانتيمتر باشد.
چرخه‌ي استريليزاسيون بايد متناسب با زمان نفوذ گرما در نظر گرفته شود، براي مثال محتويات يك ظرف يك ليتري محيط كشت بايد طي 15 دقيقه از زمان رسيدن محفظه به دمايc ˚121، به اين دما برسد.

73. استريليزاسيون مواد مصرفي آلوده
مواد مصرفي آلوده را جدا نموده و در كيسه‌هاي قابل اتوكلاو قرار دهيد و بر روي آنها برچسب خطر بیولوژیک (Biohazard) نصب كنيد.
براي اطمينان از نفوذ بخار به همه قسمت‌هاي كيسه، يا گره آن را شل كنيد يا قبل از محكم كردن گره، يك پيمانه (0.3 ليتر) آب به آن اضافه كنيد.
براي جلوگيري از مسدود شدن آبگذر اتاقك اتوكلاو توسط آگار مذاب، كيسه‌ها را داخل سطل فلزی قرار دهيد.
زمان لازم براي استريليزاسيون زباله، دقيقه در 121 درجه سانتيگراد يا دقيقه در 134 درجه سانتيگراد مي‌باشد.

74. استريليزاسيون مواد خشك بسته بندي شده از قبیل سوآب و لوله آزمایش:
بسته‌ها را طوري در اتوكلاو قرار دهيد كه حداكثر چرخش بخار در بين آنها ايجاد شود وبا ديواره‌هاي اتوكلاو نيز تماسي نداشته باشند.
کنترل اتوکلاو با تست شيميايي:
نوار كاغذي TST Tempreture ,Steam ,Time)): این نوار در هر سری کاری سه عامل زمان، بخار و دما را كنترل مي‌كند و از زرد به بنفش تغيير رنگ مي‌دهد.

75. کنترل اتوکلاو با تست بيولوژيك:
استفاده از ويال حاوي اسپور باسيلوس استئاروترموفيلوس ATCC بطور هفتگي سفارش مي‌شود، زیرا اسپورهای این باکتری به عنوان مقاوم‌ترین اسپورها به حرارت در اتوکلاو با درجه حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه از بین می‌روند. پس از پایان استریلیزاسیون، ویال را خارج کرده و با فشار به جداره آن محوطه درونی حاوی اسپور را می‌شکنند تا اسپورها در محیط کشت آزاد شوند؛ سپس این محیط را در حرارت 55 درجه سانتیگراد قرار داده و در مدت یک هفته از نظر تغییر رنگ اندیکاتور موجود محیط کشت را کنترل می‌کنند. در صورتی که تغییر رنگ مشاهده نشد یعنی اسپورها در اثر استریلیزاسیون مرده‌اند و استریلیزاسیون کامل صورت گرفته است در صورت تغییر رنگ اندیکاتور محیط کشت یعنی اسپورها زنده مانده‌اند.

76. راهبردهای ايمني هنگام کار با اتوکلاو:
از دستكش مقاوم به حرارت و محافظ چشم استفاده كنيد.
بعد از اتمام کار وقتي فشار اتاقك اتوكلاو به صفر رسيد درب آنرا باز كنيد. منتظر بمانيد تا ظروف كمي خنك شوند، سپس آنها را حمل كنيد.
هرگز در هنگام روشن بودن دستگاه اقدام به بارگذاري يا خارج نمودن وسايل و مواد ننماييد.
هرگز در هنگام روشن بودن دستگاه و اتصال الکتریکی آن به پريز، اقدام به تميز نمودن آن نكنيد.
هرگز پيچ‌هاي محكم كننده‌ي درب را در هنگام كار دستگاه شل و سفت نكنيد.

77. منابع :
- Quality Assurance for commercially prepared Microbiological Culture Media-Second Edition ; Approved standard.- Third edition document M22-A3. Vol. 24 No.19; 2006.
Oxoid company- General Guide to the use of Oxoid culture Media.
Diagnostic microbiology, Elmer W.Koneman,5th edition, 2006: page 96
-Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard—Ninth Edition (2006).M2- A9.
-Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard—Seventh Edition (2006).M7-A7
-Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard— Third Edition (2004).M22-A3
-Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Sixteenth Informational Supplement (2006).M100-S16

78. 9- محيط هاي كشت آزمايشگاهي (موارد مصرف وكنترل كيفي) به انضمام اطلس رنگي محيط هاي كشت؛ گرد آوري و ترجمه مهناز صارمي – محمد علي صارمي؛ آزمايشگاه مرجع سلامت، وزارت بهداشت، درمان وآموزش پزشكي؛ 1387
10-مباحث عملی میکروبیولوژی عمومی، مجتبی محمدی، انتشارات مهدیس، 1381
11-باکتری شناسی عملی، هادی صفدری، جهاد دانشگاهی مشهد، 1382
12-تکنیک‌های عملی در آزمایشگاه میکروب شناسی، دکتر سیدعلی مهبد، انتشارات کتاب امیر، 1386
13-نکاتی پیرامون آزمایشگاه میکروبیولوژی، مؤلف cappoccino& Sherman، مترجم مریم محمدی، انتشارات جنگل، 1380

79. تهيه و تنظيم :
فرزانه رفيعي
سميه ميرزايي پور
تابستان 1393