1. Glükolüüs

2. Tsitraaditsükkel Enne loengut
Enne loengut
Meelde tuletada:
tsitraaditsükli vaheühendite nimetused
koensüümid FADH2, CoA, TPP

3. Glükolüüs
Glükolüüs on rada, millega glükoos konverteeritakse püruvaadiks. Selles protsessid moodustub 2 ATPd
Küsimused
10 ensümaatilist etappi
Reaktsioonide keemia ja ensüümide töömehhanism
Glükolüüsi energeetika
Glükolüüsi kontroll

5. Glükolüüsi ajaloost Pagaritööstus ja veinitööstus
Louis Pasture- fermentatsioon on seotud mikroorganismidega
1897 Eduard Buchner- fermentatsioon rakuvabas ekstraktis, elujõudu pole vaja
Arthur Harden ja William Young
anorgaaniline fosfaat vajalik
zymaasi ja cozymaasi fraktsioonid dialüüsi abil
1940 Gustav Embden, Otto Meyerhof, and Jacob Parnas.

6. Glükolüüsi ülevaade
1. Glükoos aktiveeritakse fosforüülimise teel.
2. Fosforüülitud vaheühendid konverteeritakse makroergilisteks ühenditeks.
3. Makroergiliste ühendite energiat kasutatakse ATP sünteesiks.
I staadium- ettevalmistav, glükoosi fosforüülimine ja poolitamine nii et tekib 2 molekuli glütseeraldehüüd-3-fosfaati, kulub 2 ATPd
II staadium glütseeraldehüüd-3-fosfaat konverteeritakse püruvaadiks, moodustub 4 ATPd ehk kogusummas võit 2 ATP molekuli ühe glükoosi molekuli kohta
Glükoos + 2NAD+ + 2ADP +2Pi  2NADH + 2püruvaati + 2ATP + 2H2O + 4H+

7. Glükolüüsil moodustuv NADH tuleb reoksüdeerida tagasi NAD+-ks
Anaeroobsetes tingimustes redutseerib NADH lihastes püruvaadi laktaadiks (homolaktaatne fermentatsioon)
Pärmis püruvaat dekarboksüleeritakse, moodustavad CO2 ja atseetaldehüüd, viimane redutseeritakse NADH poolt etanooliks (alkohoolne fermentatsioon)
Aeroobse metabolismi korral oksüdeeritakse NADH hingamisahelas, protsess seotakse 2.5 ATP sünteesiga

9. Heksokinaas Glükoos Glükoos-6-fosfaat
Mg++
+ ATP
+ ADP + H+
Glükoos Glükoos-6-fosfaat
Isosüümid: ensüümid, mis katalüüsivad sama reaktsiooni, erinevad kineetiliste parameetrite osas.
Koespetsiifika
Glükokinaas- maks kontrollib vere glükoosi taset
Lihaste heksokinaas – allosteeriline inhibitsioon ATPga
Aju heksokinaas – ATP ei ole allosteeriline inhibiitor

10. Heksokinaasi reaktsioonimehhanism Juhuslik Bi-Bi
Glükoos ATP ADP Glu-6-PO4
Miks ei toimu ATP hüdrolüüsi ilma glükoosi juuresolekuta?
Glükoosi sidumine põhjustab struktuurse muutuse ensüümi ruumilises ehituses, mis teeb katalüüsi võimalikuks.

11. Ensüümi struktuurse muutusega kaasneb ATP asetumine glükoosi 6-OH rühma vahetusse lähedusse ja vee eemaldamine aktiivtsentrist
Ksüloosi juuresolekul kiireneb ATP hüdrolüüs korda. Ksüloosi struktuur meenutab glükoosi, aga teda ei ole võimalik fosforüülida
a-D-Xylose

12. Pärmi heksokinaasi konformatsiooni muutus glükoosi sidumisel
Pärmi heksokinaasi konformatsiooni muutus glükoosi sidumisel. Substraadi poolt indutseeritud struktuuri muutus võimaldab vältida soovimatut ATP hüdrolüüsi.

13. Glükoosfosfaadi isomeraas
Reaktsioon kulgeb üle enedioolaat intermediaadi
1) Substraat seondub
2) Tsükkel avatakse happelise rühma atakeerimisega (H2N-Lys)
3) Protoneerimata Glu kui alus võtab ära prootoni C2 küljest
4) Prootoni vahetus
5) Tsükkel sulgub uuesti

14. Glükoosi keemiline isomerisatsioon

16. Fosfofruktokinaas Fruktoos-6-PO4 Fruktoos-1,6-bisfosfaat
Mg++
+ ATP
+ ADP
Fruktoos-6-PO Fruktoos-1,6-bisfosfaat
1.) Glükolüüsi kiirust limiteeriv etapp
2.) Pöördumatu reaktsioon
3.) Esimene unikaalne reaktsioon rajas

17. Retro-aldoolkondensatsioon
Aldolaas
Dihüdroksüatsetoon fosfaat (DHAP) +
Glütseeraldehüüd-3-fosfaat (GAP)
Fruktoos -1,6-bisfosfaat (FBP)
Retro-aldoolkondensatsioon

18. 2 aldolaaside klassi
Klass I loomad, taimed – vaheühendiks Schiffi alus 1
1. Substraat seondub
2. FBP karbonüül reageerib Lys aminorühmaga, tekib imiiniumkatioon. (Schiffi alus)
3. C3-C4 side katkeb, tekib enamiin ja vabaneb GAP
4. Enamiin protoneerub, moodustub imiiniumkatioon
5. Imiiniumkatioon hüdrolüüsub, vabaneb DHAP +
+ NaBH4

19. Klass II aldolaas- seened, vetikad. Ei moodusta Schiffi alust
Klass II aldolaas- seened, vetikad. Ei moodusta Schiffi alust. Karbonüülne intermediaat polariseeritakse divalentse katiooni, tavaliselt Zn+2 poolt.

21. Aldolaasi stereospetsiifika
Põhimõtteliselt on DHAP with GAP kondensatsiooni tulemuselt 4 erineva produkti teke

22. Trioosfosfaadi isomeraas
DHAP GAP
TIM on perfektne ensüüm, mille kiirus on difusiooni poolt kontrollitud
Kiire tasakaalu tõttu on võimalik vastavalt vajadusele kiiresti ära kulutatud GAP asendada DHAP arvelt

23. TIM reaktsioon kulgeb üle enediooli
GAP
enediool
DHAP
Üleminekuoleku analoogid fosfoglükohüdroksamaat (A) ja 2-fosfoglükolaat(B) seonduvad TIM-ga vastavalt 155 ja 100 korda tugevamini kui GAP või DHAP B. A.

24. TIM üleminekuolek- spetsiifilised madala barjääriga vesiniksidemed

25. Glütseereraldehüüd-3-fosfaadi dehüdrogenaas
Esimene makroergiline intermediaat
+ NAD+ + Pi
+ NADH
Tarbib 1,3-bisfosfoglütseraadi sünteesiks anorgaanilist fosfaati

26. GAPDH reaktsiooni mehhanism

28. GAPDH katalüüsi etapid
1. GAP seondub ensüümiga.
2. Nukleofiilne SH atakeerib aldehüüdi, moodustub tiohemiatsetaal.
3. Tiohemiatsetaal oksüdeeritakse atsüültioestriks elektronide ülekandega NAD+ koosseisu, tekib NADH.
4. NADH eraldub ja asendatakse NAD+ poolt.
5. Tioestrit atakeerib Pi, tekib 1,3 BPG.
Tegemist on fosfaati sisaldava makroergilise anhüdriidiga.

29. Arsenaat on fosfaadi analoog, mis hüdrolüüsub spontaanselt
3PG
GAP DH + +

31. Fosfoglütseraadi kinaas: Esimene ATP tekke etapp
+ ADP
+ ATP
3 PG
1,3 BPG

32. GAP + Pi + NAD+ 1,3 -BPG + NADH + 6.7 kJ mol-1
1,3 BPG + ADP PG + ATP kJ mol-1
GAP+Pi+NAD+ +ADP 3PG+NADH+ATP kJ mol-1

33. Fosfoglütseraadi mutaas
2PG
3 PG
2,3 BPG

34. Ainult fosforüülitud ensüümi vorm on aktiivne
Ainult fosforüülitud ensüümi vorm on aktiivne. Ensüümi fosforüülimine on võimalik ainult 2,3BPG abil.
Fosfohistidiin

36. Glükolüüs mõjutab hapniku transporti

37. Hapnikuga küllastamise kõverad erütrotsüütides

38. Enolaasi reaktsioon- teine makroergiline vaheühend
+ H2O
2-fosfoglütseraat fosfoenoolpüruvaat

40. Püruvaadi kinaas- teise ATP moodustumine

41. Glükolüüsi teine pool

42. Püruvaat katabolismis

43. NAD+ regenereerimine NADH-st
A. Homolaktaatne fermentatsioon: püruvaadi konversioon laktaadiks
LDH
Püruvaat NADH L-Laktaat NAD+
Imetajatel on 2 erinevat tüüpi isosüüme
M lihastes
H südames

44. Laktaadi dehüdrogenaas on tetrameerne valk
H4 omab madalat Km püruvaadi suhtes ja on allosteeriliselt inhibeeritud püruvaadi kõrgel kontsentratsioonil.
M4 on kõrge Km püruvaadi suhtes, ei ole allosteeriliselt reguleeritud
Kõikvõimalikest vormide: H4, H3M, H2M2 HM3, M4. M on valdav anaeroobset tööd tegevates lihastes, kus moodustub palju laktaati. H4 domineerib aeroobsetes kudedes (süda), kus on eelistatud püruvaadi teke laktaadist.

45. Pro-R hüdriid kantakse üle NADH C4-lt püruvaadi C2 aatomile samaaegselt loovutab prootoni ka His195
Lihastes tekkiv laktaat transporditakse maksa, kus see konverteeritakse tagasi glükoosiks

46. Alkohoolne fermentatsioon
2 etapiline protsess:
1) Püruvaadi dekarboksülaas kasutab kofaktorina tiamiinpürofosfaati (TPP).
2) Alkoholi dehüdrogenaasi kofaktor on Zn+2

47. TPP
Dekarboksüleerimisel akumuleerub negatiivne laeng karbonüülsel süsinikul, mis teeb üleminekuoleku ebastabiilseks, TPP aitab seda negatiivset laengut stabiliseerida.

48. Püruvaadi dekarboksüleerimise reaktsiooni mehhanism
1. Karbonüülset süsinikku atakeeritakse TPP üliidvormi poolt
2. CO2 lahkub, karbanioon on resonantsstabiliseeritud
3. Karbaniooni protoneerimine
4. TPP üliidvormi elimineerimine, moodustub atseetaldehüüd.

49. Alkoholi dehüdrogenaas

50. Fermentatsiooni energeetika
DG'
Glükoos lakataat + 2H kJ• mol-1 glükoosi
Glükoos 2CO2 + 2etanool kJ• mol-1 glükoosi
2ATP moodustumine kJ• mol-1
See tähendab 31% ja 26% energia salvestamise efektiivsust
Füsioloogilistes tingimustes on see ligi 50%

52. Glükolüüs- kiire ATP süntees
Glükolüüs 100 korda kiirem kui ATP süntees oksüdatiivse fosforüülimse abil mitokondrites

53. Metabooliitide voo kontrollf
Statsionaarses olekus J = const
Statsionaarses olekus on metaboliitide voog läbi raja konstantne ja voogu kontrollitakse:
1) Vastavalt organismi vajadustele võib voogu määrav etapp erineda
2). Voo muutus mõjub kõigile raja etappidele

54. Substraadi tsüklid ja voo kontroll

55. Kui metaboliitide voog suureneb, siis DJ põhjustab [A] suurenemise, seetõttu omakorda Dvf . DJ = Dvf
Asendame Michaelis-Menteni võrrandisse

57. vf/(vf-vr) on reaktsiooni kiiruse muutumise tundlikkuse mõõt vastusena substraadi kontsentratsooni muutustele
Pöördumatu reaktsiooni korral läheneb vr 0-le ja vf/(vf-vr) 1-le. Seetõttu vajab reaktsioon pea kiiruse muutusega sarnases suurusjärgus olevat substraadi kontsentratsiooni muutust.
Tingimustes kus reaktsioon läheneb tasakaalule , läheneb vr vf--le ja seega vf/(vf-vr) lõpmatusele. Seetõttu on reaktsioni kiiruse muutmiseks palju väiksemat muutust substraadi kontsentratsioonis.

58. Metaboliitide voogu kontrollitakse kiirust limiteeriva reaktsiooniga
Kiirust määrav reaktsioon on tavaliselt mitetasakaaluline. Tingimustes, kus vf>>vr , on voo muutus DJ/J proportsionaalne substraadi kontsentratsiooni muuduga. Glükolüüsi raja voog muutub enam kui 100 korda, substraadi kontsentratsiooni nii suures piirides muuta ei saa. Kasutatakse:
Allosteerilist regulatsiooni
Kovalentset modifikatsiooni
Substraadi tsükleid
Geneetilist kontrolli

59. Kovalentne modifitseerimine- valkude fosforüülimine

60. Vabaenergia muutused glükolüüsi rajas
Reaktsioon ensüüm DG´ DG
1 Heksokinaas
2 PGI
3 PFK
4 Aldolaas
5 TIM
6+7 GAPDH+PGK PGM
9 Enolaas
10 PK

61. Ainult kolme ensüümi DG on suure negatiivse väärtusega
Heksokinaas, fosfofruktokinaas, püruvaadikinaas
Teised ensüümid töötavad tasakaalulistes tingimustes, nende kiirus on suurem kui voog läbi raja.
Ensüüm Inhibiitor Aktivaator
Heksokinaas G6P ?
PFK ATP, tsitraat, PEP ADP, AMP, cAMP
F2,6BP, F6P
NH4, Pi
Püruvaadi kinaas ATP ?

62. PFK: glükolüüsi võtmeensüüm lihaskoe rakkudes

63. PFK aktiivsuse sõltuvus G6P kontsentratsioonist

64. AMP, kuid mitte ATP kontsentratsioon kontrollib glükolüüsi
ATP kontsentratsioon kõigub rakkudes olenevalt olekust (puhke/aktiivne tegevus) vaid 10%. [ATP] puhverdatakse kreatiinfosfaadi ja adenülaatkinaasi poolt.
2ADP ATP + AMP
10% ATP kontsentratsiooni vähendamine põhjustab 5x AMP hulga tõusu. ATP = 50AMP lihastes. AMP aktiveerib PFK adenülaadi kinaasi reaktsiooni toimel.

65. Substraadi tsüklid Fruktoos-6 fosfaat +ATP Fruktoos 1,6-bisfosfaat
Fruktoos 1,6-bisfosfaat Fruktoos -6 fosfaat + Pi
Summaarne tulemus on ATP hüdrolüüs.
Seda tsüklit kontrollivad 2 ensüümi, PFK and fruktoos 1,6 bisfosfataas. Kui neid mõlemaid ei kontrollitaks, toimuks futiilne tsükkel.
Glükolüüsi spetsiifilised efektorid
Ensüüm Inhibiitor Aktivaator
Fosfataas AMP ATP, tsitraat

67. Tsitraaditsükkel

68. Tsitraaditsükkel
Tsitraaditsükkel, Krebsi tsükkel, trikarboksüülhapete tsükkel. Enamus süsivesikute, rasvhapete ja aminohapete oksüdatiivsetest protsessidest. Sama oluline biosünteesil- amfiboolne, st osaleb nii katabolismis kui anabolismis
3NAD+ + FAD + GDP + Pi + acetyl-CoA
3NADH + FADH + GTP + CoA + 2CO2

69. Kataboolse metabolismi ülevaade

70. Tsitraaditsükli ensüümid paiknevad mitokondri maatriksis
Substraadid peavad kontrollitult liikuma mitokondrist sisse ja välja

72. Nathan Kaplan and Fritz Lipmann Koensüümi A avastajad, Ochoa and Lynen näitasid, et AcCoA on intermediaadiks püruvaadi konversatsioonil tsitraadiks.

74. CoA on atsetüüli kandjaks
AcCoA on makroergiline ühend: Hüdrolüüsireaktsiooni DG' on kJ• mol-1 ehk napilt rohkem kui ATP-l.
Püruvaadi dehüdrogenaas konverteerib püruvaadi AcCoA-ks ja CO2 -ks

75. Püruvaadi dehüdrogenaas
PDH kompleksi moodustavad omavahel mittekovalentselt assotsieerunud ensüümid. PDH kompleks katalüüsib tervet rida reaktsioone, mida vajatakse AcCoA sünteesiks püruvaadist lähtuvalt.
Mw 4,600,000 Da
E. coli pärm
Püruvaadi dehüdrogenaas E
Dihüdrolipoüüli transatsetülaas --E
Dihüdrolipoüüli dehüdrogenaas --E

76. 24 E2 s E a + b
12 E3 (tumedam)

77. Pärmi PDH E2 EM kujutis
60 subühikut on assotsieerunud kui 20 trimeeri, mis moodustavad korrapärase ruumilise struktuuri

78. Milleks on ensüümide kompleksid kasulikud?
1 Diffusiooni poolt limiteeritud protsesside minimaliseerimine .
2. Vaheproduktidega toimuvate kõrvalreaktsioonide minimaliseerimine
3. Koordineeritud kontrolli võimalus

79. Eukarüootse püruvaadi dehüdrogenaasi kovalentne modifitseerimine

80. Püruvaadi dehüdrogenaasi kompleksi 5 reaktsiooni

81. TPP
Dekarboksüleerimisel akumuleerub negatiivne laeng karbonüülsel süsinikul, mis teeb üleminekuoleku ebastabiilseks, TPP aitab seda negatiivset laengut stabiliseerida.

82. Püruvaadi dekarboksüleerimise reaktsiooni mehhanism
1. Karbonüülset süsinikku atakeeritakse TPP üliidvormi poolt
2. CO2 lahkub, karbanioon on resonantsstabiliseeritud
3. Karbaniooni protoneerimine
4. TPP üliidvormi elimineerimine, moodustub atseetaldehüüd.

83. PDH kompleksis toimub 5 reaktsiooni ja osaleb 5 erinevat kofaktorit
Püruvaat + CoA + NAD AcCoA + CO2 + NADH

84. PDH kofaktorid Kofaktor asukoht funktsioon
Tiamiin Seotud E1ga Püruvaadi
pürofosfaat dekarboksüleerimine
Lipoehape kovalentselt aktsepteerib E2 Lys jäägil hüdroksüetüül (lipoamiid) karbaniooni TPP-lt
CoA E2 substraat aktsept. atsetüüli lipoamiidilt FAD (flaviin) seot. E3-ga reduts. Lipoamiidi poolt
NADH E3 substraat reduts. FADH2

85. Dihüdrolipoüüli transatsetülaasi (E2) struktuur

86. Püruvaadi dehüdrogenaasi kompleks
Püruvaat dekarboksüleeritakse PDH poolt kasutades TPP kofaktorina, tekib hüdroksüetüül-TPP.
E2 lipoamiid oksüdeeritud vormis aktsepteerib hüdroksüetüüli, tekib atsetüül-dihüdrolipoamiid-E2
3. E2 katalüüsib atsetüüli ülekande CoA külge, tekib AcCoA ja redutseeritud dihüdrolipoamiid-E2.
Dihüdrolipoamiidi DH E3 reoksüdeerib dihüdrolipoamiid-E2, redutseerub prosteetiline rühm FADH2 kujul.
Redutseeritud E3 is reoxksüdeeritakse NAD+ poolt, tekivad FAD and NADH. SH rühmad reoksüdeeritakse FAD poolt ja elektronid kantakse üle NADH-le

87. + +

88. FAD
FAD S SH S SH + +
NAD+ NADH + H+
FAD
FADH2
FAD SH S S SH S S

89. Arseen ja PDH