1. Biokeemiline katalüüs ja metabolism

2. Loengukursus Biokeemia II  
Toimumisaeg: 30. august -3. oktoober 2005
Biokeemiline katalüüs ja metabolism
Biokeemiline termodünaamika ja metabolism
 BLOKK: süsivesikute metabolism
Glükolüüs
Pentoosfosfaadi rada
Tsitraaditsükkel
Glükoneogenees
Glükogeeni metabolism. Süsivesikud toitainetena
Fotosünteetiline süsivesikute süntees
 BLOKK: ATP süntees
Mitokondriaalne hingamisahel
ATP süntees eluslooduses
 BLOKK: lipiidide metabolism
Lipiidide katabolism
Lipiidide biosünteesist
 BLOKK: Lämmastikku sisaldavate ühendite metabolism
Lämmastiku fikseerimine. Aminohapete biosüntees
Aminohapete süsiniku katabolism
Aminohapete lämmastiku katabolism. Uurea tsükkel
Püriinide ja pürimidiinide metabolism
 BLOKK: metabolismi integratsioon
Keemilised reaktsioonid metabolismis
Kofaktorid ja vitamiinid
Metabolismi integratsioon imetaja organismis I
Metabolismi integratsioon imetaja organismis II

3. Ensüümid- biokatalüsaatorid
Praktiliselt kõik metabolismi reaktsioonid on ensümaatilised
Kiirendavad reaktsioone sageli 106 to korda
Ensüümid ei muuda reaktsioonide DG
Ensümaatilised reaktsioonid kulgevad pehmetes tingimustes
Ensümaatilised reaktsioonid on spetsiifilised
Ensümaatilised reaktsioonid on sageli reguleeritavad

4. Substraadispetsiifilisus
Substraadi spetsiifilisus taandub eelkõige spetsiifililisele kompleksi moodustamisele mittekovalentsete jõudude abil
Van der Waals jõud
Elektrostaatilised jõud (ioonsed sidemed)
Vesinikside
Hüdrofoobne interaktsioon

5. alkoholi dehüdrogenaas
Ensüümide stereospetsiifika O
Pärmi
alkoholi dehüdrogenaas

6. Pärmi alkoholi dehüdrogenaas
NAD+
CH3CD2OH +
Ox. O +
CH3C-D
Red.
Reaktsioonis eemaldatakse Pro-R vesinik
NADD
Pärmi alkoholi dehüdrogenaas

7. O 2. NADD + CH3-C-H O 3. CH3-C-D + NADH
Juhul kui kasutada erinevat enantiomeeri, ei toimu D ülekannet
YADH on Pro-R stereospetsiifiline

8. Ensüümide geomeetriline spetsiifika
Sarnase struktuuriga homoloogilise rea ühendid on sageli ühe ja sama ensüümi substraadiks
Vastavad ühendid võivad erineda teatud asendaja või isegi keemilise sideme osas

9. Ensüümreaktsioonide kineetika
Ensümaatilised reaktsioonid on nulljärku kui substraadi kontsentratsioon on kõrge. Nulljärku tähendab, et reaktsiooni kiirus ei kasva substraadi kontsentratsiooni kasvades.
Sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon glükoosiks ja fruktoosiks
sahharoos + H2O glükoos + fruktoos
invertaas

10. E = Ensüüm S = Substraat P = Produkt
ES = Ensüüm-Substraat kompleks
k1 pärisuunalise reaktsiooni kiiruskonstant
k-1 = ES substraadiks tagasi lagunemise reaktsiooni kiiruskonstant
k2 = produktide moodustamise reaktsiooni kiiruskonstant

11. [ES] hulk on määratud tema moodustumise ja lagunemise kiiruste vahega.
Kui substraadi kontsentratsioon on piisavalt kõrge, on kogu ensüüm seotud ES kujul kompleksi. Reaktsiooni teine etapp saab kiirust limiteerivaks, sest rohkem ES moodustuda ei saa ehk ES kontsentratsioon on maksimaalne.
[ES] hulk on määratud tema moodustumise ja lagunemise kiiruste vahega. 1

12. Eeldus I- tasakaalulisuse eeldus
k-1>>k2 ehk produkti moodustumise kiirus on palju aeglasem ES kompleksi tekke kiirusest
Sellel juhul kehtib järgmine võrrand:
Ks on ES kompleksi dissotsiatsioonikonstant

13. Eeldus II- statsionaarse oleku eeldus
Reaktsiooni vaadeldakse kulgevana tingimustes, kus ES kontsentratsioon ei muutu 2

14. 3
kombineerides
Korraldades ümber
Jagame k1 läbi ja avaldame [ES]
Selles võrrandis

15. Michaelis - Menteni võrrand
vo on siin reaktsiooni algkiirus st tingimustes kus reaktsioon on just alanud.
reaktsiooni maksimaalne kiirus
Michaelis - Menteni võrrand

16. Km vastab substraadi kontsentratsioonile, kus vo on pool Vmax väärtusest

17. Topelt pöördteljestikus graafik

18. KM ja kcat omavad varieeruvaid väärtusi erinevate ensüümide ja substraatide korral
The KM
on väljendatav kui:
Kui Ks väheneb, suureneb ensüümi afiinsus substraadi suhtes. Seega on KM substraadi afiinsuse mõõduks tingimustel kui k2<k-1

19. Michaelis -Menteni kineetika korral k2= kcat
Kui [S] << KM moodustub väga vähe ES ja [E] = [E]T
Nendes tingimustes:
kcat/KM on katalüütilise efektiivsuse mõõt

20. Täiuslik ensüüm katalüüsi aspektist?
Kui k2>>k-1 või suhe
on maksimaalne
Iga substraadi molekul, mis seondub ensüümiga konverteeritakse produktiks- see on katalüütiline perfektsus
Siis
Diffusiooni poolt kontrollitud piir- substraadi diffusiooni kiirus on suurusjärgus 108 to 109 M-1s-1. Ensüüm alandab üleminekuoleku energeetilist barjääri nii, et katalüüsi kiirus on määratud ära substraadi ja ensüümi molekulide kokkupõrke kiirusega.

21. Ensümaatilise aktiivsuse regulatsioon
2 meetodit ensüümi aktiivsuse kontrolliks
1. Kontrolli olemasoleva ensüümi hulka
2. Kontrolli ensüümi katalüütilist aktiivsust.
Ensüümi hulk rakus sõltub sünteesi kiirusest ja degradatsiooni kiirusest
Ensüümi süntees kontrollitakse transkriptsiooni ja translatsiooni tasemel
Degradatsioon on samuti reguleeritud (avaldub ensüümide poolestusaja erinevuses)
Ensüümaatilise aktiivsuse regulatsioon on eelmistest kiirem

22. Ensüümi katalüütilise aktiivsuse muutmiseks võib:
-muuta ensüümi molekuli konformatsiooni
-teha kovalentseid modifikatsioone
Ensüümi aktiivsust võidakse reguleerida kas aktiveerides või inhibeerides.
Spetsiifiliselt saab väikeste efektormolekulidega mõjutada ka ainult katalüütilist saiti.
Kovalentne modifikatsioon:
-aktivatsioon spetsiifilise proteolüüsiga
-valkude fosforüülimine Ser (Thr, Tyr) jääkidel. Sageli hormonaalselt kontrollitud ja toimub korraga paljudes kudedes

23. Aspartaadi Transkarbamoülaas: Pürimidiinide biosünteesi esimene etapp.
ATCaas +
H2PO4- +
Karbamoüül Aspartaat N-Karbamoüül aspartaat fosfaat
ATCaas on kontrollitud allosteeriliselt metaboolse raja lõppprodukti poolt - tagasiside

24. NB! Pane tähele kõverate S kuju!
Positiivne homotroofne effekt
Heterotroofne inhibeerimine CTP poolt
Heterotroofne aktiveerimine ATP poolt

25. Inhibeerimine tagasiside kaudu
Metaboolse raja produkt inhibeerib iseenese sünteesi mõjutades raja esimest unikaalset (commited) reaktsiooni

26. CTP on raja produkt ja DNA ning RNA sünteesi prekursor
CTP on raja produkt ja DNA ning RNA sünteesi prekursor. Kiire nukleiinhappe sünteesi korral väheneb CTP hulk rakus ja ATCaasi aktiivsus suureneb. Kui ATCaasi aktiivsus on suurem kui vaja st CTP hakkab akumuleeruma, seondub CTP ensüümiga ja inhibeerib aktiivsuse.
ATP aktiveerib ATCaasi. Puriine ja pürimidiine on vaja RNA ja DNA sünteesis ligikaudu samas hulgas. Kui ATP kontsentratsioon on kõrgem kui CTP kontsentratsioon, seondub ATP ATCaasiga ja aktiveerib viimase seniks kuni CTP kontsentratsioon samuti tõuseb.

28. Ensüümreaktsioonide inhibiitorid
Inhibiitorid jaotatakse
-pöörduvad (konkurentsed, mittekonkurentsed, ebakonkurents.
-pöördumatud

29. Pöörduvad inhibiitorid jaotatakse omakorda: konkurentsed
mittekonkurentsed
ebakonkurentsed
Konkurentne inhibiitor- sarnaneb normaalsele substraadile ja konkureerib sellega samasse tsentrisse sidumise pärast
Mittekonkurentne inhibiitor- seonduvad mitte aktiivtsentrisse vaid kuhugi mujale, aga mõjutavad sellega ensümaatilist aktiivsust
Ebakonkurentne inhibiitor- sarnanevad mittekonkurentse inhibiitoriga, ent seonduvad ainult ES kompleksiga.
substraat
substraat
substraat
Konkurentne
inhibiitor
mittekonkurentne
inhibiitor
ensüüm
ensüüm
ebakonkurentne
inhibiitor
ensüüm

30. Ensüümreaktsioonide inhibiitoritest II
Konkurentne inhibiitor- konkureerib substraadiga ensüümile sidumises
Mõju avaldub aktiivse substraadi seondumises osaleva ensüümi
kontsentratsiooni alanemises; vmax jääb samaks, Km suureneb
Km*=aKm
a=1+[I]/Ki

31. Ensüümreaktsioonide inhibiitorid IV
Ebakonkurentne inhibiitor, seondub ES kompleksiga, ei seondu vaba ensüümiga. Seega ei sega ES kompleksi moodustumist vaid ainult katalüüsi. Harvaesinev, multisubstraatse katalüüsi korral.

32. Müoglobiini ja hemoglobiini struktuur
Andrew Kendrew ja Max Perutz 1959 kuni 1968.
Struktuuri analüüs on võimaldanud küsida fundamentaalseid küsimusi. Kuidas seondub hapnik, kuidas realiseerub kooperatiivne sidumine, millised on punktmutatsioonide efektid struktuurile ja funktsioonile.
Müoglobiin: 44 x 44 x 25 Å üks subühik 153 aminohappe jääki
121 jääki kuulub heeliksite koosseisu. Heeliksid A, B, C, …F. Heemi tasku moodustavad E ja F. Ka heeliks H asub heemi lähedal.

33. Hemoglobiin ja müoglobiin
Veri on punane...
Esimene kristalliseeritud valk
Esimene valgu korrektne molekulmass.
Esimene röntgenstruktuuranalüüs.
Esimene ultratsentrifuugiga uuritud valk.
Esimene valk, mille funktsioon osutus füsioloogias oluliseks.
Esimene funktsiooni omav punktmutatsioon.
Koperatiivse seondumise ja allosteeria fenomenid esimest korda analüüsitud

34. Müoglobiini ruumiline struktuur

36. Heemi kompleks müoglobiiniga

37. Hemoglobiin
4 subühikuline valk, molekul 64 x 55 x 50 Å sümmeetriline a and b subühikud on sarnased D heeliks puudub hemoglobiini a ahelas. Erinevate subühikute vahel moodustuvad ulatuslikud kontaktid a2-b2 või a1-b1 piirpinnal 35 jääki, a1-b2 and a2-b1 19 jääki, mis on kontaktis.
Hapniku sidumine hemoglobiini molekuliga toob kaasa olulised struktuursed muutused

38. Deoksü- ja oksühemoglobiini kvaternaarne struktuur
R-olek
T-olek

39. Mis põhjustab R ja T oleku erineva konformatsiooni?
Oksügeenimine pöörab a1b1 dimeeri a2b2 dimeeri suhtes umbes 15°
Deoksü oleku konformatsiooni nimetatakse T olekuks
Oksü oleku konformatsiooni nimetatakse R olekuks
Mis põhjustab R ja T oleku erineva konformatsiooni?
Kuidas on see seotud hapniku sidumisega?

40. O2 sidumise positiivne kooperatiivsus Hb molekuliga tekib sellest, et ligandi seondumine ühe heemiga mõjutab konformatsiooniliste muutuste kaudu ligandi sidumise afiinsust teiste heemidega.
Fe ioon paikneb deoksü oleku korral 0.6 Å eemal heemi tasapinnast. Hapniku sidumine viib raua tagasi heemi tasapinda. Proksimaalne His F8 on seotud Fe iooniga ja tõmbab endaga kaasa kogu F heeliksi.

43. Esimese hapniku molekuli sidumine Hb heemiga on raskem, kuid sellega kaasneb a1-b2 kontaktide muutus ja distaalsete His E7 and Val E11 eemaldumine sellest kohast, kuhu hapnik seondub teistes subühikutes Fe iooniga. Sellega kaasneb hapniku afiinsuse kasv heemi suhtes- positiivne kooperatiivsus.
a1-b2 kontaktidel on 2 stabiilset positsiooni.
Vastavad kontaktid on stabiliseeritud 2 erineva vesiniksidemete komplektiga- binaarne ümberlüliti T ja R oleku vahel.

45. T R üleminek saavutatakse Fe-O2 sideme moodustumise energia arvel.
Hemoglobiini O2 –sidumise kooperatiivsus tuleneb T  R konformatsiooni muutusest.
Fe aatom ei saa paikneda heemi tasapinda ilma et toimuks proksimaalse His asukoha muutus, mis vastasel korral põrkuks porfüriini tsükliga
Proksimaalne His on väga tihedalt ümbritsetud naabruses asetsevate aatomite poolt ja ei saa reorienteeruda ilma terve F heeliksi liikumiseta.
F heeliksi liikumine on ainult võimalik kui üheaegselt toimub muutus kvaternaarse struktuuri tasemal, mille käigus a1C-b2FG kontakt liigub ühe sammu võrra piki a1C heeliksit.

46. a1-b1 ja a2-b2 piirpindade jäikuse tõttu on see nihe võimalik ainult nii, et korraga toimuvad muutused nii a1-b2 kui ka a2-b1 piirpinnal.
Tulemusena ei saa üks subühik eraldi konformatsiooni muuta.
KAS ÜKS VÕI MITTE ÜKSKI
Ühe subühiku t olek, millel on madalam afiinsus hapniku suhtes transformeerub r olekuks ilma hapnikku sidumata kui mõni teine subühik seob hapniku molekuli. Sellised r olekus subühikul on hapniku suhtes kõrgem afiinsus.

48. T ja R oleku hapniku sidumise kõver annab summana eksperimendis täheldatava S kujulise sõltuvuse

49. Hemoglobiini funktsioon
a2,b2 dimeer, sarnased müoglobiinile
Transpordib hapnikku kopsudest kudedesse.
O2 difusioon on liiga ebaefektiivne suurte loomade jaoks.
O2 lahustuvus on plasmas madal, i.e M.
Seotuna hemoglobiinile on [O2] = 0.01 M, ehk sama mis õhus
Alternatiivsed O2 transporterid;
Hemotsüaniin, Cu sisaldav valk.
Hemerütriin, heemi mittesisaldav valk.

50. Müoglobiin vahendab hapnikku lihaskoes
O2 diffusiooni kiirus kapillaaridest kudedesse on aeglane
Müoglobiin kiirendab difusiooni sidudes hapniku.
Hapnikuvarude salvestamine?

51. Heem Müoglobiin ja iga hemoglobiini subühik sisaldab heemi.
Heem seob ühe hapniku molekuli
Heem on heterotsüklilise porfüriini derivaat (protoporfüriin IX)
Raud on Fe(II) ehk redutseeritud vormis
Heem seob hapniku Fe(II) kuuenda ligandina väljaspool heemi tasapinda. Viies ligand on histidiin heeliksist F, mis on teisel pool heemi tasapinda.

53. O2 sidumine müoglobiiniga
Avaldame küllastatuse astme ehk fraktsionaalse küllastatuse

54. Hapniku kontsentratsiooni mõõtmiseks kasutatakse tavaliselt partsiaalrõhku pO2
P50 = hapniku partsiaalrõhu väärtus, kui YO2 = 0.50
Millise kujuga on vastav sõltuvus?
Mida ütleb P50 väärtus O2 sidumise kohta?

55. Hapniku P50 väärtus müoglobiini korral on 2.8 torri
1 torr = 1 mm Hg = kPa
760 torri = 1 atm
Mb ei vabasta eriti O2 hapniku normaalsete füsioloogiliste kontsentratsioonide korral
i.e torri arteriaalses veres
30 torri in venoosses veres
YO2 = 0.97 kuni YO2 = 0.91
Milline on P50 väärtus Hb jaoks?

57. Hilli võrrand 2. 1. O2 on näiteks ligand E = ensüüm, S = ligand, n= n
Fraktsionaalne küllastatus = seotud/summaarne

58. 3. Teeme pisikese kombinatsiooni 1. + 2. = 3. ehk
Analoogiline valem sellele, mis kirjeldas Mb + O2 kompleksi välja arvatud n
n- Hilli konstant, mis suureneb kui sidumise kooperatiivsus suureneb, n=1, mittekoperatiivne
n>1, positiivne koperatiivsus, n<1, negatiivne koperatiivsus

59. Hilli graafik

61. Süsinikdioksiidi transport ja Bohri effekt.
Kõrgema pH juures st madalama [H+] korral seondub hapnik tugevamalt hemoglobiiniga
Madalam pH st kõrgem [H+] soodustab hapniku vabanemist hemoglobiinilt
T  R üleminekul muutub mitme rühma pK. N-terminaalsed aminorühmad moodustavad % Bohr effektist. His146b 40%, sest R olekus kaob ioonne side Asp 94b jäägiga.

63. Aeroobse metabolismi tagajärjel tekib CO2
Aeroobse metabolismi tagajärjel tekib CO2. Punastes verelibledes katalüüsib karboonanhüdraas järgmist reaktsiooni, mille tulemusena ei teki probleemi gaasi transpordiga. Iga tarbitava mooli hapniku kohta moodustub 0.8 mooli CO2.
H+, mis moodustub selle reaktsiooni tulemusena seotakse Hb poolt ja see põhjustab täiendava hapniku vabanemise. Samal ajal stimuleerib prootonite sidumine CO2 transporti kuna stimuleeritakse vesinikkarbonaadi moodustumist.

64. D-2,3-bisfosfoglütseraat (BPG)
BPG seondub hemoglobiiniga ja vähendab afiinsust hapniku suhtes stabiliseerides desoksü vormi
BPG seob 1:1 (K=1x10-5 M) desoksü vormiga aga nõrgalt oksü vormiga

65. BPG seondub spetsiifiliselt desoksü vormiga ja stabiliseerib seega T vormi. R olekus on tsentraalne ava liiga kitsas selleks, et BPG mahuks seonduma.

66. Hemoglobiini P50 väärtus suureneb 12lt 22 torrini 4.7 mM BPG toimel

67. 100 torri hapniku partsiaalrõhu juures arterites on hemoglobiin 95% küllastatud
A30 torri juures veenides on hemoglobiin 55% küllastatud
Hemoglobiin vabastab 40% transporditavast hapnikust. Ilma BPG juuresolekuta vabaneb vaid väike kogus hapnikku.