1. טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית
1. שיבוט cloning - : טכניקה לבידוד מקטע DNA
2. ריצוף DNA (sequencing)
3. PCR
4. microarray )ביו-ציפ (וריצוף עמוק.
התרגיל להורדה:

3. אנזימי רסטריקציה

5. Cohesive = מתלכד
5’ overhang
3’ overhang

7. cloning

9. Polylinker or Multiple Cloning Site (MCS)

10. פלסמיד השיבוט

13. Plasmid cloning

14. האם ניתן לשבט מקטע דנא שנחתך בשתי הקצוות באינזים שחותך קצה ישר (blunt ends) לתוך פלסמיד שגם הוא נחתך עם אותו אינזים רסטריקציה?
אי אפשר כי אין נקודת אחיזה
אפשר כי מבחינה הסתברותית קצה ישר יגיע למגע עם קצה ישר שני

15. כמה אפשריות חיבור (אורינטציות) יש בין פלסמיד שנחתך באינזים רסטריקציה שיוצר קצוות ישרים (blunt) לבין רצף שני של DNA שנחתך באותו אינזים
1. אחד
2. שניים
3. שלוש
4. ארבע

16. טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית
1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים
2. שיבוט
3. ריצוף DNA (sequencing)
4. PCR (polymerase chain reaction)
5. microarray ביו-ציפ.

17. Taq polymerase
Taq polymerase: is a thermostable DNA polymerase named after the thermophilic bacterium Thermus aquaticus from which it was originally isolated by Thomas D. Brock in 1965.

18. PCR – polymerase chain reaction
30 sec for 1Kb = elongation

19. PCR first
PCR-2
In vitro mutagenesis / site-directed mutagenesis – מומלץ לצפייה
Creating transgene mouse

20. The PCR product on the gel

21. Site-directed mutagenesis

22. עזרה בתרגיל F R תרגיל בשיבוט-2014 אורך פריימר לא פחות מ-18 בסיסים
עזרה בתרגיל F R
תרגיל בשיבוט-2014
אורך פריימר לא פחות מ-18 בסיסים

23. טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית
1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים
2. שיבוט
3. ריצוף DNA (sequencing)
4. RCP
5. microarray ביו-ציפ.

24. מכשיר ריצוף DNA אוטומטי

25. ריצוף הגנום האנושי

26. גרג וונטר

27. 454/Roche, Solexa/Illumina, ABI/Solid
Deep-sequencing
Noam Shomron / Tel Aviv University / The RNA World / January 2010
454/Roche, Solexa/Illumina, ABI/Solid

28. NEW OLD $3 billion 10 years 20,000 BACs 100kb > 2-3kb vectors
Noam Shomron / Tel Aviv University / New Horizons in RNA processing / Nov-Dec 2009

29. טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית
1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים
2. שיבוט
3. ריצוף DNA (sequencing)
4. RCP
5. microarray ביו-ציפ.

30. Principle of Microarray (Chip) Assay
Prehybridization
Posthybridization
Synthetic DNA probes
Probes with hybridized DNA

31. microarray
Genome microarray

32. כל נקודה מצינת
גן מאוקטב.
סוג הצבע ורמתו
מיצגים את רמת
הפעלת הגן

33. תוכנית ה-MD/PhD

34. ChIP-on-chip TF TF Antibody Binding sites Genomic Arrays
We use a strategy known as ChIP-on-chip. As shown in this slide, a population of cells are treated with formadehyde to crosslink the DNA binding protein and their substrate in vivo. Then we sonicate the genome to break up the chromosome into small fragments, and use an antibody the specifically recognize the transcription factor to purify the complexes from the cell extract. This is known as ChIP, first invented by John Lis more than 2 decades ago. The second chip standards for microarrays, which are used to identify the enriched DNA sequneces. are then amplified, fluorescently labeled and identified through hybridization to a DNA microarray containing genomic sequneces for the orgnanism. The DNA microarray data is analyzed by statistics method and the target sites are can be simultaneously identified.
Genomic Arrays

35. ChIP-seq in a nutshell

36. טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית
1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים
2. שיבוט
3. ריצוף DNA (sequencing)
4. PCR
5. microarray ביו-ציפ.

37. Gel electrophoresis ג'לים
1. ג'ל דנטורטיבי חלבונים – SDS
2. ג'ל דנטורטיבי DNA או RNA – אוראה או פורמאמיד
3. ג'ל נטיבי (מצבו הטיבעי של חלבון/DNA/RNA בתא) לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-RNA או DNA לא מוסיפים חומרים הגורמים לדנטורציה.

38. הפרדות על גבי ג'לים

39. Gel electrophoresis ג'לים
1. ג'ל דנטורטיבי חלבונים – SDS
2. ג'ל דנטורטיבי DNA או RNA – אוראה או פורמאמיד
3. ג'ל נטיבי (מצבו הטיבעי של חלבון/DNA/RNA בתא) לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-RNA או DNA לא מוסיפים חומרים הגורמים לדנטורציה.

40. Native gel

41. תרגיל בשיבוט – ד.נ.א רקומבינטיבי
1. הוטל עליך לשבט חלק מהרצף הגנומי של הגןsurvival of motor neuron 1 (SMN1) מאקסון 7 עד אקסון 9 (כולל).
הרצף המופיע בתמונה הוא רצף pre-mRNA הנגזר מתוך הרצף הגנומי העומד לרשותך (האם ה-3’ UTR הוא חלק
מאקסון 8?).
2. כמו כן לרשותך פלסמיד אשר לתוכו תשבט את הרצף הנדרש באתר ה- polylinker (תמונה 2).
3. במעבדה שלושה אינזימי חיתוך (רסטריקציה) ואתרי החיתוך שלהם מופיעים בתמונה מספר 3.
4. כמו כן במעבדה קיים האנזים RNA polymerase T7 בלבד שישמש אותך בהמשך המחקר בסנטזת ה-ר.נ.א של הגן המשובט.
5. כיצד תשבט את אקסון 7 עד 9 (כולל) של הגן SMN1 : פרט כל שלב ושלב (מהגברת מקטע הגן עצמו ועד שלב הפקת הפלסמיד), באיזה אנזימים תשתמש, רשום את רצף שני הפריימרים שתזמין, ומה יהיה עליך להזמין בנוסף על כך ?
6. מה יהיה עליך לעשות על מנת לקבל את ה pre-mRNA של הגן (אך ורק אותו!) ?
הערה: ניתן לסנטז את ה pre-mRNA במבחנה (in-vitro), אז כיצד תסנטז את רצף ה-pre-mRNA מבלי לסנטז את רצף הפלסמיד שנמצא downstream לאקסון מספר 9?
במעבדה ישנו מכשיר PCR, קיט תעשייתי להפקת פלסמיד (מאפשר להפיק פלסמיד מכמות גדולה של חיידקים) וכמו כן ניתן להזמין פריימרים (רצפי התחל).
ראקציית ה- PCR מתבצעת ע"י ערבוב החומרים והכנסתם למכשיר ה- .PCR

42. תמונה 1: רצף גנומי חלקי של הגן survival of motor neuron 1 . (SMN1)
Exon – red upper case
Intron – black lower case
Amino acids –under the center of the codon

43. תמונה 2: פלסמיד השיבוט
polylinker

44. תמונה 3: אתרי חיתוך של שלושה אינזימי רסטריקציה
Products generated by restriction enzymes
Cohesive ends
5’ G AATTC 3’
3’ CTTAA G 5’
EcoRI
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
BamHI
5’ GGATCC 3’
3’ CCTAGG 5’
5’ G GATCC 3’
3’ CCTAG G 5’
XhoI
5’ CTCGAG 3’
3’ GAGCTC 5”
5’ CTCGA G 3’
3’ G AGCTC 5’