1. בעזרת microplate reader
קביעת חלבון כמותית
בעזרת microplate reader

2. * חשיבות: כמות חלבון/אנזים פעילות מעקב אחר תהליך בידוד וניקוי של חלבון
קביעת חלבון כמותית
חשיבות:
כמות חלבון/אנזים פעילות
מעקב אחר תהליך בידוד וניקוי של חלבון
איפיון חלבון מסויים
התכונות הנדרשות משיטת הכימות:
סלקטיביות (selectivity) - חלבון X חומצת גרעין/סוכר
רגישות (sensitivity) – mg, mg
שיטות הכימות העיקריות מבוססות על תכונות הבליעה:
photometric
colorimetric *

3. חוק Beer: הבליעה a לריכוז
העיקרון של כל שיטות המדידה הפוטומטריות
חוק Beer: הבליעה a לריכוז

4. THE ELECTROMAGNETIC SPECTRUM
Energy
Wavelength (meter)
Low
> 1x10-1
Radio
1x x10-3
Microwave
1x x10-7
Infrared
7x x10-7
Optical
4x x10-8
Ultraviolet - UV
1x x10-11
X- ray
High
< 1x10-11
Gamma-ray

5. שיטות כימות:
ע"פי בליעה בתחום ה- uv:
לדוגמה: בליעת חלבון ב l = 280 nm
הבליעה נובעת משיירי tyrosine ו- tryptophan
יתרון: שיטה פשוטה ומהירה – אין צורך בריאגנטים/טיפול
החלבון נשמר במצבו המקורי לשימושים נוספים
חסרון: בליעת חומצות גרעין ב l = 280 nm
פי 10 יותר

6. 2. ע"פי תגובת צבע (colorimetric assays):
שיטות כימות:
2. ע"פי תגובת צבע (colorimetric assays):
יתרון: אין בליעת חומצות גרעין ב l בתחום הנראה
חסרון: החלבון אינו מתאים לשימושים נוספים
BIURET
LOWRY
BRADFORD
מדידה בתחום הנראה (optical)
העיקרון המשותף: תמיסה הנמדדת + ריאגנט
צבע a כמות/ריכוז החלבון

7. שיטת BIURET עיקרון: יצירת קומפלקס בין יוני נחושת דו-ערכיים (Cu2+)
עיקרון: יצירת קומפלקס בין
יוני נחושת דו-ערכיים (Cu2+)
ואטומי חנקן בקשרים פפטידיים בח"א
tyrosine
tryptophan
cysteine
יתרון: מינימום הפרעות ע"י ריאגנטים הנמצאים בתמיסה
חסרונות: רגישות לא גבוהה (mg)
נפח הריאקציה = 5 ml
הפרעה ע"י מלחי אמוניום

8. שיטת LOWRY הנפוצה ביותר
עיקרון: תגובה של יוני נחושת דו-ערכיים בסביבה אלקלית (biuret)
יוני נחושת חד-ערכיים + שיירים על ח"א
אמפליפיקציה של הצבע ע"י תגובה עם folin
tyrosine
tryptophan
cysteine
l = nm

9. יתרונות: - UVרגישות פי 10 -20
שיטת LOWRY
יתרונות: - UVרגישות פי
Biuret - הגברת הרגישות ע"י תגובה עם folin:
טווח: 10 – 100 mg
נפח הריאקציה = 1ml
חסרונות: תהליך דו-שלבי
משך: ~ 40 – 60 דקות (UV – מיידי, BIURET ~ 30 דקות)
רגישות ל pH (10 – 10.5)
חלק מהמרכיבים לא יציבים
הפרעה ע"י דטרגנטים, Tris, סוכרים, כו'
הטווח הליניארי צר יחסית

10. עיקרון: מולקולת צבע coomassie blue G250 l מכס' = 465 nm
שיטת BRADFORD
עיקרון: מולקולת צבע coomassie blue G250 l מכס' = 465 nm
קשירה לחלבון l מכס' = 595 nm
קשירה לאיזורים הידרופוביים של החלבון
בעיקר ח"א arginine & lysine
שינוי בצבע: חום כחול
l = 595 nm

11. רגישות יותר גבוהה פי 4 מ- :Lowry מיקרו = 1 – 20 mg מקרו = mg 200 – 20
שיטתBRADFORD
יתרונות: מהירה 5 דקות
נפח הריאקציה = ml
רגישות יותר גבוהה פי 4 מ- :Lowry
מיקרו = 1 – 20 mg
מקרו = mg 200 – 20
מיעוט של הפרעות – בעיקר דטרגנטים
חסרונות: לא מתאים לחלבונים עם מיעוט ח"א arginine
ליניאריות פחות עקבית
רקע גבוה (תמיסת Bradford חומה)

12. שיטה
טווח הרגישות UV
20 mg – 3 mg
Biuret
1 – 10 mg
Lowry
10 – 100 mg
Bradford
1 – 200 mg

13. מה באמת מודדות שיטות הכימות...
מה באמת מודדות שיטות הכימות...
BRADFORD
arginine
lysine UV
tryptophan
tyrosine
BIURET
אטומי חנקן
LOWRY
tryptophan
tyrosine
cysteine
תכולה חריגה של השיירים הנמדדים תגרום
להטעיה בקביעת ריכוז חלבון

14. עוצמת הבליעה של החומר הנבדק
מכשור
spectrophotometer
Spectroscope Photometer
מודד את
עוצמת האור
שעוברת
דרך התמיסה
מייצר אור
מונוכרומטי:
l נתון
עוצמת הבליעה של החומר הנבדק
microplate (ELISA) reader - אותו העיקרון

15. מיכשור למדידות קולורימטריות
ספקטרופוטומטר – מדידה ידנית יחידנית במבחנה / קיווטה (cuvette)
microplate reader - מדידה מרוכזת ב"plate" רב-בארית
רוחב הקיווטה = 1 cm
השפעה לנפח הדגימה

16. שיטות קולורימטריות - עקומת כיול
Standard curve
בד"כ: BSA ייצוג אקראי של ח"א
כמויות ידועות של החלבון +
כמות קבועה של ריאגנט הצבע הנבחר ?

17. מהו הפתרון כאשר ריכוז החלבון> מהרגישות של שיטת הכימות?
מיהול
מיהול
מיהול
מיהול

18. מהו ה “blank” ?
ריכוז החלבון הנמדד = 0
ריאגנט הצבע + תמיסה
= מינימום הבליעה
מוגדר כ- 0 בליעה
מה חסרון השימוש במים כ “blank”?

19. THE END!

20. מתבצע בטמפ' החדר

21. xenon-flash lamps produce light over a broad spectrum, allowing measurements from 200 nm to 1000 nm.

22. Electromagnetic Spectrum - electromagnetic radiation can be described in terms of a stream of photons, each traveling in a wave-like pattern, moving at the speed of light and carrying some amount of energy. It was pointed out that the only difference between radio waves, visible light, and gamma-rays is the energy of the photons.
“Electromagnetic” is another term for “light".
Light waves are fluctuations of electric and magnetic fields in space.
Photon – the smallest quantum (unit) of energy of light:
it is defined to have zero mass & no electric charge

23. For example:
hemoglobin appears red because the hemoglobin absorbs blue and green light rays much more effectively than red.
The degree of absorbance of blue or green light is proportional to the concentration of hemoglobin. (Beer’s Law)