1. Možnosti diagnostiky zápalových ochorení čreva v skríningu nepriamou imunofluorescenciou (NIF)
P. Gomolčák, K. Beráková,, D. Cvejkušová, I. Mačugová, F. Kiš, D. Paulenová
NIF, ako skríningová metóda pri vyhľadávaní, monitorovaní autoimunitných ochorení
je metódou voľby pre klinika ale aj pomoc
pre patológa pri klasifikácii zápalových ochorení, kde vonkajšia infekcia alebo iný
škodlivý vplyv nie sú priamou príčinou ochorenia
Cytopathos, spol. s r.o. Bratislava

2. IBD je chronické ochorenie čreva zahrňujúce dve hlavné entity :
Text hore ....na týchto ochoreniach sa možno tiež podielajúpatogénne faktory
ako sú potravinové antigény a bežná črevná flóra. Je potrebné si uvedomiť, že na
rozdiel od iných AI ochorení
CD a UC vznikajú v „nesterílnych“ podmienkach
Ulcerózna kolitída (UC)‏
Crohnová choroba (CD)‏

3. Diagnostika IBD a diferenciácia
medzi CD a UC sú založené na kombinácii výsledkov:
klinických prejavov
laboratórnej diagnostiky
radiológie
endoskopie
histopatológie
serológie
10 – 17 % pacientov nedeterminovaná kolitída (IC).

4. Klasický mikroskopický obraz u neliečenej
Ulceróznej kolitídy a Crohnovej kolitídy
UC CD
Difúzny, submukózny Segmentálny, transmurálny
Rektálne postihnutie Rektum variab. postihnuté
Zhoršenie distálne Variab.stupeň závažnosti
Bez fisúr Fisury, sinusy, fistuly
Bez transmurálneho šírenia Transmurálne šírenie
Bez ilealneho postihnutia Postihnutie ilea a horného
( s výnimkou „backwash“) GIT
Bez granulómov Granulómy
Lymfoid.hyperpl.zriedkavá Lymfoidná hyperplázia
Výraznejšia krypt-deštrukcia Krypt-deštrukcia mierna

5. Porovnanie bioptických nálezov pri infekčnej kolitíde, m
Porovnanie bioptických nálezov pri infekčnej kolitíde, m.Crohn a ulceróznej kolitíde (modifikované podľa Borcharda, 1999)
infekčná kolitída
m.Crohn
UC v remisii
UC aktívna
porušenie krypt - +
+(++)
+++
nepravidelný povrch
rozšírenie baz.vrstvy (1)
bazálna fibróza (1)
metaplázia Panetových bb. (1)
-/+
redukcia pohárikovitých bb.
granulocyty ++
bazálne lymfocyty/plazmocyty
+(+)
kontinuálny zápal
diskontinuálny zápal
+(+)2
kryptálne abscesy
edém sliznice
(+)
granulómy
-/(+)
obrovské bunky
1 - pri chronickom priebehu
2 - po terapii

6. Neobvyklé histopatologické manifestácie ostatných typov kolitíd
- ischemická
liekovo asociovaná ( NSAID, HATK )
infekčná/ akútna self-limited (yersin., salmon., shig., campylobacter, aeromonas,
enterovírusy, CMV, HSV, protozoa)
imunodeficitné stavy (primárne, sekundárne)
postradiačná
mikroskopické - manifestujúce sa ako IBD
kolitídy pri divertikulóze
- vaskulitídy
- diverzná kolitída
pseudopolypózne zmeny imitujúce IBD (SRUS, inflamatórna polypóza, juvenilná polypóza)‏

7. Limity
Špecifický typ nemožno vždy rozlíšiť, dif. dg. úvahou v náleze však môžeme „naviesť“ klinika
Histologicky dôležité zmeny môžu byť fokálne a teda vo vzorkách nezachytené
Nutná klinicko-patologická korelácia

8. Princíp a definícia NIF
Detekcia cirkulujúcich orgánovo špecifických a orgánovo nešpecifických protilátok na tkanivových rezoch, bunkových náteroch a bunkových kultúrach nepriamou imunofluorescenčnou metódou(NIF) je IN SITU vyšetrenie, pri ktorom dokazujeme prítomnosť protilátok v sére pacienta demaskovaním komplexu pomocou fluorochrómom značenej protilátky.
Cirkulojúce protilátky môžeme dokázať NIF testom. Základným predpokladom testovania je použitie substrátu, ktorý bude predpokladaným cieľom
Pre protilátky vyšetrovaného séra , vymenovať org. Špecif, nešpecifické, substráty ....Princíp metódy spočíva v naviazaní neznámej protilátky zo séra
Pacienta na antigén, ktorým je cieľový antigén v substráte a jeho vizualizácia značenou protilátkou. Cieľové štruktúry musia byť pre protilátku prístupne
Mali by čo najviac kopírovať stav v in situ podmenkách. Preto je stabilizácia v krajnom prípade špecifická fixácia prvoradým predpokladom úspešného dôkazu.

9. AUTOIMUNITNÝ IMUNITOU OVPLYVNENÝ
Zhonghui Wen., Claudio Fiocchi:
Inflamatory bowel disease: Autoimmune or immune-mediated pathogenesis Clin. Develop. Immunology., 9/10, 2004, Vol. 11(3/4), pp
AUTOIMUNITNÝ
IMUNITOU OVPLYVNENÝ
Prítomnosť protilátok a autoprotilátok (ASCA, ANCA, cirkulujúci komplement fixačný faktor, anti-F(ab)2, a iné),
potenciálne autoantigény (hTM5, IFP, kardiolipin, pankreatický proteín a iné),
aktivovaný komplement, mikrocievach mukózy, črevnom epiteli v spojení s IgG1 protilátkami,
neboli nájdené orgánovo – špecifické protilátky.
Nerovnováha Th1/Th2 lymfocytov, Th1 odpoveď s vysokou produkciou IL-12, IL-18, a interferon-γ pri CD,
Th2 odpoveď CD1d-restricted NK T bunkami s vysokou produkciou IL pri UC
aktivácia dendritických buniek,
Črevná flóra „No bacteria, no colitis“

10. Autoprotilátky pri IBD
ANCA (NSA) – neutrophil – specific antibodies
ASCA – Anti Saccharomyces ceravisiae antibodies
AGCA (GAB) – Anti goblet cells antibodies
APACA (AICA) - Anti pancreas acinus cell antibodies
AhTMA – anti human tropomyosin 5 antibodies
AECA (AEndA) – Anti endothelial cells antibodies
ANA - anti nuclear antibodies

11. pANCA (NSA) neutrophil – specific antibodies
atyp. pANCA
cANCA
Hlavné autoantigény asociované s UC sú lokalizované na periférii jadier neutrofilov. NSA väčšinou nereagujú s azurofílnymi granulárnymi komponentami PR3 a MPO.
Pacienti s UC, ktorí majú zároveň PSC - frekvencia NSA takmer 85 %.
Pacienti s UC bez súčasnej PSC - frekvencia NSA je okolo 15 %.
Takmer 50 %pacientov nedeterminovanou kolitídou nemá ANCA ani ASCA protilátky.
Budúce štúdie by mali objasniť, či táto skupina pacientov nereprezentuje samostatnú klinickú entitu.

12. cathepsin G, laktoferín
Diagnóza
TYP
Prevalencia
Antigén
Ulceratívna kolitída
pANCA
50% - 80%
cathepsin G, laktoferín
cANCA
43%
BPI
Crohnova choroba
10% - 20%
neznámy
Wegenerova granulomatóza
iniciačná fáza
50%
PR3
15%
MPO
aktívna fáza
90%
remisia
30% - 40%
Churg-Strauss syndrom
60%
0% - 30%
Mikroskopická palyangitída
75%
Pauci-imunna nekrotizujúca GN (RPGN)
60% - 90%
PSC
cathepsin G
35% RA
20%
laktoferín, elastáza, cathepsin G, lyzozým
Reumatoídna vaskulitída
SLE
25%
laktoferín, elastáza, lyzozým
Feltyho syndrom

13. AGCA (GAB) Anti goblet cells antibodies
AUTOANTIGÉN
V roku 1959 Broberger a Perlmann
autoprotilátky proti zložkám mucínu
produkovaného črevnými GC
Metódou voľby pre dôkaz AGCA je nepriama IFL metóda na nefixovanom ľudskom fetálnom čreve skupiny „0“.
Fetálne črevo eliminuje nešpecifickú reakciu proti bakterialným a potravinovým antigénom.
V pozitívnych prípadoch sú AGCA viditeľné v epitelových bunkách sliznice čreva.
Testy môžeme vykonávať aj na bukových kultúrach adenokarcinómu hr. čreva línia HT29-18-N2, ktoré diferencijú do mucin produkujúcich buniek.

14. AGCA (GAB) Anti goblet cells antibodies
HT29-18-N2
Goblet cells majú makro aj mikroskopicky rovnakú lokalizáciu ako ochorenie.
V tenkom čreve sú menej časté, ale jedna vedľa druhej v hrubom čreve smerom k rektu.
Najvyšší výskyt pohárikovitých buniek je v kryptách.
Deplécia GC je charakteristickejším znakom pri UC ako pri CD.
Doposiaľ nie je jasné čí AGCA majú primárnu alebo sekundárnu úlohu v patogenéze UC.
Sú AGCA jednoducho epifenoménom spojeným s T-ly riadenou deštrukciou GC?
Primárny efekt je oveľa pravdepodobnejší, pretože AGCA majú nízky výskyt u pacientov s rozvinutou aktívnou formou UC.
Sekundárny efekt môže spočívať v porušení funkcie mucínu ako ochrannej bariery.

15. ULCERATÍVNA KOLITÍDA ASCA AGCA 83 % pANCA AGCA hTM5 64%
asociovaný s aktivitou ochorenia
ULCERATÍVNA KOLITÍDA
AGCA
pANCA/NSA
76 %
28 %
83 %
10 %
2 %
ASCA
AICA
0 %
1 %
4 %
2 %
6 %
IgA
IgG
ASCA
IgM
13 %
3 %
39 %
58 %
IgA
IgG
pANCA
8 %
23 %
69 %
IgA
IgG
AGCA
darcovi krvi

16. Anti-glykanové protilátky
nové možnosti diagnostiky IBD.
anti-laminaribiosid carbohydrat – IgG (ALamCA) S.c.
anti-mannobiosid cyrbohydrat – IgG (AManCA) S.c.
anti-chitobiosid carbohydrat – IgA (AChiCA)‏
44 %
ASCA negatívnych sér pacientov s CD obsahuje ALamCA, alebo AChiCA.
Pacienti s IBD s pozitivitou protilátok ALamCA, AChiCA, alebo ASCA
mali CD so senzitivitou 77,4 % a špecifitou 90,6 %.
Pri pozitívite najmenej dvoch týchto protilátok sa špecifita zvýši na 99,1 %.

17. ASCA Saccharomyces ceravisiae
ASCA protilátky sú namierené proti zbytkom manózy polysacharidu mannan v bunkovej stene kvasiniek Saccharomyces cerevisiae.
Objavujú sa tiež žvýšené hodnoty protilátok proti pektínu a iným polysacharidom.
ASCA je skôr asociovaná s ťažkým ochorením tenkého čreva, s penetráciou CD a môže byť diagnostikovaná aj roky pred manifestáciou klinických prejavov.

18. APACA (AICA) pancreas acinus cell antibodies
AICA môžu mať význam pri vyhľadávaní pacientov so skorým alebo stredným stupňom CD.
AICA protilátky neboli nájdené ani u jedného pacienta s UC resp. negat. kontrol.
Protilátky proti sekréčnym komponentom pankreasu sú pravdepodobne epifenoménom , ktorý môže byť spôsobený krížovou reakciou s iným antigénom napr. bakteriálneho pôvodu a sú zodpovedné za spustenie a udržanie zápalu čreva s adjuvantným efektom v dôsledku čoho sú pacienti silno imunizovaní proti baktériam črevnej flóry.

19. APACA (AICA) pancreas acinus cell antibodies
Drop-like staining
Speckled staining
Typ I.
Typ II.
obidva typy sú špecifické pre CD
vyskytujú sa aj u prvostupňových príbuzných pacientov s IBD
Seibold, F., Scheurlen, M., Muller, A. et al. Impaired pancreatic function in patients with Crohns disease with and without
pancreatic abnormalities. J Clin Gastroenterology, 1996, 22(3),
Seibold, F., Mork, H., Tanza, S.et al.: Pankreatic autoantibodies in Crohns disease: a family study. Gut, 1997, 40,

20. Tropomyozín
AhTM5 Vi Ak
Tropomyozíny sú IFP nájdeme vo všetkých eukaryotických bunkách a sú asociované s aktínom. CK TM
Nárast protilátok bol zaznamenaný pri UC, RA, SS
Popísaných je 5 izoform hTM1 – 5
izoformy hTM1, hTM2 a hTM3 sa vyskytujú hlavne v hladkej svalovine tenkého čreva a v stenách ciev nie však v epiteli.
izoforma hTM4 je lokalizovaná v bunkách endotelu a bazálnej membráne epitelu hrubého čreva

21. Tropomyozín
AhTM5
AhTM5 sú špecifické protilátky v sére pacientov s UC, ktoré indukujú vznik C3b depozít a deštruujú epitel čreva.
IF test 79 % senzit., 100 % špecifitu
hTM5 je predominantná izoforma epitelu hrubého čreva a niektorých
extraintestinálnych orgánov
nevyskytuje sa v epiteli tenkého čreva, a ezofágu, žlčových kanálikoch
silno reaguje s epitelom kože, extrahepatálnych žlčovodov, veľkých
interlobárnych duktoch a s epitelom močového mechúra.

22. Tkanivové substráty s pozitivitou hTm5
Žlčník
Koža
Črevo

23. Celiakia - séro pozitívny pacient

24. Ďakujeme za pozornosť