1. 4. Miško medžių genetinė inžinerija
4.1. Genetinės inžinerijos samprata (genų identifikacija ir rekombinantinė DNR).
4.2. Genetinės inžinerijos metodai.
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai.
4.4. Genetinės inžinerijos taikymo ypatumai miškų ūkyje.

2. 4.1. Genetinės inžinerijos samprata
Genų inžinerija (sin. genetinė modifikacija) tai dirbtinė genų modifikacija ląstelėje ir nelytinio genų perkėlimo metodų naudojimas tikslinei požymių, produktų ir procesų modifikacijai (FAO 2004).
Genetinė modifikacija tai tikslingas svetimų genų įterpimas.
Genetiškai modifikuotas organizmas (GMO)- tai organizmas į kurio genų visumą (genomą) yra įterptas svetimas genas (ai). a) b) c) d) e)
Genetinės modifikacijos principas- svetimų genų įterpimas (a) bakterijos DNR molekulė, (b) bakterijos DNR sukarpoma spec. enzimų pagalba (c) naujas genas (d) naujas genas įstatomas į DNR grandinę (e) genetiškai modifikuota (rekombinuota) DNR molekulė.
4.1. Genetinės inžinerijos samprata (1)

3. Genomika: genų identifikacija
Norinti modifikuoti požymio genetinį sąlygotumą reikia identifikuoti su požymio išraiška susijusius genus.
Genomika tai palyginti nauja genetinių tyrimų šaka, kurios pagrindinis tikslas yra identifikuoti genus ir jų funkcijas.
Pagrindiniai genų identifikacijos etapai:
Požymio ir molekulinio žymes ryšio ir požymių genų lokusų nustatymas
Kandidatinių genų identifikacija, DNR sekvenavimas ir genų ekspresijos skirtumai.
Genomo sekų analizė ir kodono pirmumo principas.

4. a) QTL paieška
20%
Kai kurie požymį sąlygojantys genai turi didesnę įtaką ar įtakuoja kitų genų veiklą (vadinami kiekybinio požymio lokusais arba QTL).
Požymių ir molekulinių žymenų sąsajos tyrimų tikslas rasti žymenis susijusias su šiais genais, galutinis tikslas- rasti pačius genus.
ŽymuoM
50%
QTL1
Požymio ir žymens sąsaja testuojama per rekombinaciją: lytinų ląstelių formavimo metu iš tėvo ir motinos gautos porinės chromosomos pasikečia dalimis. Galimi 4 genotipai: M-G; M-g; m-G; m-g
Požymis kontroliuojami eilės genų, kurių įtaka išreikšta procentais (pavyzdžiui kuo didesnis procentas tuo daugiau medienos)
QTL2
15% M m g
ŽymuoN 5% G 5%
a) žymuo M ir genas G nesusiję nes rekombinacijos metu pateko į skirtingas sankibos grupes
b) žymuo m ir genas g yra susiję nes rekombinacijos metu pateko į vieną sankibos grupę 5%

5. b) Genų paieškos principai
Genų ekspresijos tyrimas (skirtingos aplinkos ar skirtingi funkciniai audiniai)  polimorfinių cDNR identifikacija  sekų nustatymas  atitikmenų paieška bibliotekose ar mikro gardelėse  geną žyminčių žymenų kūrimas (EST).
Už žiedinių struktūrų brandinimą atsakingų genų paieška atliekama tikrinant genų ekspresiją pumpuro užuomazgos ir vegetatyviniuose audiniuose
Sekvenavimas
Išreikšta
iRNA
cDNA
DNR
microgardelės: hibridizacija su žinomų genų dalimis
cDNR
cDNR atitinkančių genų paieška bibliotekose
Specifinės sekos žyminčios abi geno puses naudojamos kaip žymenys
GTATAGGTCTCTGT
Žinomų genų dalių DNR gardelė
Kandidatinio geno seka

6. c) Genų paieška DNR sekose
Sekmenuotose genomuose galima ieškoti jau žinomų genų atitikmenų naudojantis informatikos priemonėmis.
Kodono pirmumo principas taikomas sekvenuotų genomų tolesnėje analizėje. Žinant tam tikra medžio biocheminėje sudėtyje gausaus baltymo pagrindinę amino rūgštį, kompiuterio pagalba galima ieškoti DNR atkarpų, kuriuose vyrauja šią amino rūgštį koduojantis tripletas (kodonas, pvz. CUG).
1,000
2,000
3,000
4,000
2.0
1.5
1.0
0.5
-0.0
For example, a simple method which is used to detect coding regions in some bacteria makes use of the preference for particular codons to encode particular amino acids in these bacteria (for example, over 80% of Leucine residues in E. coli are encoded by the codon CUG, in preference to the codons CUU, CUC and CUA). In organisms where there is a marked codon bias this method can be successful especially for detecting highly expressed genes, by plotting the correspondence between the codon usage in the organism and the various reading frames of the sequence being studied.
Legend for the figure above:
A) reading frame 1 B) reading frame 2
C) reading frame 3 D) large open reading frame in frame 2
E) In this region of reading frame 2, the agreement between the codon usage in the reading frame and the codon usage in the organism is high as shown by the curve rising high above the baseline. This, together with the long open reading frame, indicates a very likely coding region.
Further reading: Staden, R. and McLachlan, A.D. (1982) “Codon preference and its use in identifying protein coding regions in long DNA sequences” Nucleic Acids Res. 10:
Analizės metu, tiksliniam kodonui suteikiamas pirmumas ir pagal kodono pasikartojimo dažnį apskaičiuojant kodono pirmumo rodiklis, kuris identifikuojamas kaip intronas ir baltymą koduojančio geno dalis.
Kodono pirmumo rodiklis

7. Restriktazės
Restriktazės tai specialūs baltymai, kurie sukarpo DNR molekulę specifinių DNR nukleotidų sekų radimosi vietose.
DNR iš medžio A
DNR iš medžio B
Cukraus 5 C atomas per fosfatų grupę jungiasi su sekančio nukleotido cukraus 3 C atomu. Žymėjimas 5’ ir 3’ nurodo cukraus C atomus. iRNR “nuskaito” DNR kodą 5 3 kryptimi
Būtent restriktazių tikslaus sukarpymo metodo atradimas davė pagrindą rekombinantinės DNR sukūrimui ir genetinei modifikacijai
Ta pačia restriktazė sukarpytos 2 skirtingos DNR molekulės gali suformuoti jungtis ir sudaryti naują DNR molekulę.
4.1. Genetinės inžinerijos samprata (3)

8. Rekombinantinė DNR
Įterpiamas naujas genas
Rekombinantinė DNR tai dirbtiniu būdu sukurta DNR molekulė, įterpiant naują geną ar jo dalį.
Bakterijos DNR (plazmidė), į kurią įterptas naujas genas
Bakterijų DNR plazminės ir tikslinis genas sukarpomi tomis pačiomis restriktazėmis.
Genas įvedamas į bakterijos plazmidę: geno ir bakterijos plazmidės DNR atkarpų galai atitinka vienas kito jungčiai ir genas inkorporuojamas į bakterijos plazmidę.
Užkrėtus augalo ląsteles, bakterijos plazmidė migruoja į augalo ląsteles ir įsiterpia į jų DNR tuo pačiu įvesdama naują geną.
4.1. Genetinės inžinerijos samprata (2)