1. انواع محیط ها وروش های کشت میکروبی (مروری برروشهای سنتی)
دکترمحمداحمدی

2. محیطهای کشت کامل (پایه)(General- Basic)
این محیط کلیه مواد لازم برای رشد باکتریها را دارد و فاقد مواد ضد میکروبی است و حدود 80% از باکتریها می توانند در آن رشد کنند . این محیطها فاقد هر گونه مهارکننده و اندیکاتور بوده ، لذا با رشد میکروبهای مختلف بر روی آن هیچگونه تغییر رنگی مشاهده نمی شود.
این محیطها برحسب مورد استفاده یا به شکل مایع (Broth)یا جامد (Agar)در این میان محیط (Plate Count Agar)P.C.A(پلیت کانت آگار) در مقایسه با (Nutrient Agar)N.A(نوترینت آگار) از کیفیت مغذی بالاتری برخوردار بوده و برای رشد میکروبها مناسب تر می باشد.
Nutrient Agar
Plate Count Agar

3. محیط های کشت انتخابی(Selective)
محیط هایی وجود دارند که دارای یک ماده مهار کننده رشد می باشند این مواد رشد تمام ارگانیسم ها بجز ارگانیسم مورد نظر را مهارمی کنند .
درمرحله اول از رنگ هایی که دارای خواص ضد میکروبی هستند استفاده می شود ودر مرحله بعد استفاده از آنتی بیوتیک ها و مرحله آخر شامل وارد کردن مواد ترکیبی به محیط کشت جهت فعالیتهای متابولیکی ارگانیسم مورد نظر می باشد .
از آنجا ئیکه این محیط ها جهت ارگانیسم مورد نظر انتخاب شده اند و برای سایر ارگانیسم ها مضر می باشند آنها را محیط های انتخابی می نامند .
مثالی از این نوع محیط ها ، محیط کشت فنیل اتیل الکل آگار است که از رشد باسیل های گرم منفی هوازی و بی هوازی اختیاری ممانعت بعمل آورده و به ارگانیسم های گرم مثبت اجازه رشد می دهد .
مثالی دیگرمانیتول سالت آگار(MSA) يك محيط انتخابي به منظور جداسازي استافيلوكوكهاي بيماريزا ( كوآگولازمثبت) از نمونه هايي كه حاوي باكتريهاي متعدد هستند بكار مي رود .غلظت زياد نمك 5/7% موجود در اين محيط مانع از رشد كوكسيهاي غير بيماريزا مي شود .

4. محیط های کشت انتخابی(Selective)
(MSA)

5. محيط هاي كشت افتراقي Differential))
محيط هايي هستند كه ميكروارگانيسم‏هاي مختلف در آن ويژگيهاي خاص خود را نشان مي‏دهند. 
مک کانکی آگار(MacConkey Agar) نوعی محیط افتراقی جامد برای متمایز کردن جمعیت زیادی ازمیکروبها است. این محیط اهمیت کاربردی زیادی در شناسایی تخمیرکننده های لاکتوز، پاتوژن های روده ای گرم منفی و جلوگیری ازرشد باکتریهای گرم مثبت دارد. این محیط دارای نمکهای صفراوی و مقدار بسیار کمی کریستال ویوله است که هر دو از رشد باکتریهای گرم مثبت جلوگیری می کنند.
کلنی باکتری های تخمیرکننده لاکتوز،محیط را به رنگ قرمز درمی آورند.رنگ قرمز درنتیجه ایجاد محیط اسیدی بوسیله تخمیر کننده های لاکتوز شکل می گیرد.
ارگانیسم هایی که نمی توانند لاکتوز را تخمیر کنند، سبب تغییر رنگ نمی شوند.

6. محيط هاي كشت افتراقي Differential))

7. محيط هاي كشت افتراقي Differential))
ائوزین متیلن بلو آکار(EMB Agar) نوعی محیط کشت افتراقی است که برای تشخیص و جداسازی باکتری های میله ای روده ای گرم منفی استفاده می شود. همچنین این محیط مانع از رشد باکتری های گرم مثبت می شود.
مبنای افتراق در این محیط بکارکیری دو رنگ شاخص یعنی ائوزین و متیلن بلو‘است که متمایزکننده تخمیرکننده های لاکتوز ازارگانیسمهای فاقد توانایی تخمیر لاکتوز می باشد. در این محیط باکتری های تخمیر کننده لاکتوز دارای کلنی هایی بامرکز تیره وحاشیه ای شفاف خواهند بود در حالیکه ارگانیسم هایی که نمیتوانند لاکتوز را تخمیرکنند، کلنی های کاملا» بی رنگ خواهند داشت.
جالب اینجاست که E.coli دراین محیط کولونی هایی
با رنگ سبزمتالیک ایجاد میکند.

8. محیطهای کشت اختصاصی(Special Media)
این محیطها برای رشد باکتریهای خاصی مناسبند . از این محیطها برای ایزوله نوع خاصی از باکتری در یک مخلوط میکربی استفاده می شود . 
مانند محیط S.S.Agarکه برای جدا کردن سالمونلا و شیگلا بکار میرود.
در محیط S.S ترکیباتی مانند پپتون ، لاکتوز ، املاح صفراوی ، نوترال رد، آگار، بریلیانت گرین ، تیو سولفات سدیم وجود دارد .
این محیط فقط اجازه رشد به باکتری های سالمونلا و شیگلا را می دهد .
بریلیانت گرین موجود در محیط مانع رشد باکتریهای گرم ـ مثبت و دیگر گرم منفی ها در محیط S.S می شود .
با استفاده از این محیط می‌توان سوشهای تخمیر کننده لاکتوز را از سوشهایی که توانایی تخمیر لاکتوز را ندارند، تشخیص داد .
سالمونلا ، شیگلا قادر به تخمیر لاکتوز نبوده، درمحیط S.S کلنی های بی رنگ ایجاد می کنند که ارزش تشخیصی دارد .
یا محیط مانیتول سالت آگار(که قبلا» تحت عنوان محیط های کشت انتخابی طبقه بندی شد) برای تشخیص گونه بیماریزای استافیلوکوکوس اورئوس استفاده می شود . 

9. محیطهای کشت اختصاصی(Special Media)

10. محیط کشت غنی کننده (Enrichment Media)
اين محيط ها معمولا در مواردي به كار مي‏روند كه تعداد ميكروارگانيسم مورد جستجو درنمونه غذائي كم بوده و يا به علت وجود زياد ميكروارگانيسم‏هاي ديگر جدا كردن آن با اشكال مواجه باشدیا باکتری سخت رشد باشد.
اين محيط ها با تركيب خاص خود از نظر pH و مواد غذائي امكان رشد براي ميكروارگانيسم مورد نظر را فراهم مي‏كند،مانند محيط گوشت پخته(Cooked Meat Broth ) براي جدا كردن کلستریدیوم ها ومحیط کشت بلاد اگار و محیط کشت شکلات اگار.

11. محیط کشت غنی کننده (Enrichment Media)
Cooked Meat Broth
Chocolate Agar
Blood Agar

12. محیط کشت انتقالی (Transport Media)
برای جلوگیری از ازبین رفتن مقداری از میکرو ارگانیسم های موجود در نمونه ای که مدتی طول میکشد تا از محل گرفتن نمونه به ازمایشگاه برسد بکار می رود مثل محیط استوارت(Stuart )

13. انواع کشت کشت باکتری در محیط کشت مایع (براث)
      ابتدا یک آنس برداشته و آنرا در دست راست بگیرید . بعد آنرا روی شعله کاملا سترون کنید و بگذارید تا سرد شود.
       محیط حاوی باکتری (لوله یا پلیت) را در سدت چپ بگیرید و درب آنرا با دست راست در کنار شعله باز کنید . دقت کنید که درب محیط کشت را روی میز کار خود نگذارید.
       اگر محیط کشت در لوله است دهانه آنرا چند با ر از روی شعله عبور دهید تا سترون شود همچنین درب لوله را بیش از حد باز نگه ندارید.
       نوک آنس را وارد محیط کرده و یک لوپ از آنرا بردارید. منظور از لوپ سوزن کشت با نوک حلقه ای است .
       دهانه لوله را مجددا با شعله سترون کرده و درب آنرا بگذارید و محیط کشت را در جای خود قرار دهید.
       لوله حاوی محیط کشت را در دست چپ بگیرید و نوک آنس آلوده  به باکتری مورد نظر را داخل محیط فرو برده و به آرامی تکان دهید تا میکروبها در محیط پخش شوند.
      در مواردی که میکروب را از پلیت (محیط کشت جامد) برمی دارید با نوک آنس کمی از پرگنه را برداشته و با رعایت موارید که گفته شد آنرا داخل محیط مایع فرو برده و به آرامی هم بزنید تا همگن شود.
      دهانه لوله حاوی محیط کشت جدید را با شعله سترون کرده و درب آنرا بگذارید و آنرا در داخل انکوباتور قرار دهید.
       نوک آنس را مجددا با شعله استریل کرده و در جای خود قرار دهید.

14. کشت باکتری در محیط کشت مایع (براث)

15. کشت باکتری در محیط کشت جامد(آگار)
    کشت باکتری در محیط کشت جامد(آگار)
محیط کشت جامد به دو صورت وجود دارد :
محیط کشت جامد در لوله
محیط کشت جامد در پلیت
در لوله به دوصورت:
عمودی(عمقی)Stab Culture))
شیبدار(Slant Culture )

16. کشت باکتری در محیط کشت جامدلوله ای عمودی(عمقی)Stab Culture))
در اینحالت محیط کشت آگاردار (جامد) را با حفظ شرایط استریل در حالت مذاب داخل لوله های آزمایش استریل ریخته و بحالت عمودی آنرا در یک جای ساکن قرار دهید تا سرد سود در اینحالت با آنس نوک تیز استریل شده در کنار شعله از پرگنه باکتری مقداری را برداشته و آنرا بصورت عمودی در مرکز این محیط تا انتها فرو برده و بدون هیچگونه تغییر حالتی آنرا از همان مسیر خارج کنید . بعد لوله را در انکوباتور قرار دهید .
این روش کشت دارای خصوصیاتی می باشد و آن اینست که هنگامی که نوک آنس را در محیط فرو می برید در ابتدای ورود آنس به محیط تراکم باکتری زیاد است و به ترتیب که به عمق محیط فرو می رود از تعداد باکتریها کاسته می شود تا به انتهای لوله که می رسد تراکم باکتری با حداقل می رسد و از طرفی در انتها محیط کشت لوله ای اکسیژن کمتر از قسمت سطحی آن است و باکتریها به ترتیبی با تراکمی که وارد محیط شده اند براساس نیاز با اکسیژن (هوازی یا بیهوازی بودن )در محیط رشد متفاوتی دارند یعنی اگر باکتری هوازی باشد رشد آن در قسمت سطحی بیشتر است و اگر بیهوازی باشد رشد آن در قسمت عمقی بیشتر می شود.

17. کشت باکتری در محیط کشت جامدلوله ای شیبدارSlant Culture))
در اینحالت محیط کشت آگاردار استریل را در لوله های استریل شده  ریخته و قبل از سرد شدن آنها را بحالت شیبدار قرار می دهند تا سرد شوند.
در اینحالت با آنس نوک تیز با حفظ شرایط استریل از پرگنه باکتری برداشته و در کنار شعله نوک آنس را ابتدا بصورت عمودی وارد قسمت عمودی محیط کشت کرده بعد به آرامی آنرا از همان مسیر خارج کرده و بدون اینکه نوک آنس از محیط جدا شود آنرا به حالت زیگزاک روی سطح شیبدار بکشید.
این روش هم خصوصیات بسیار زیادی از جهت تشخیص سویه های باکتری دارد و اطلاعاتی در مورد هوازی  یا بی هوازی بودن آنها و همچنین خصوصیات منحصر به فرد باکتریها به ما می دهد . مثلا ممکن است درکشت یک نوع باکتری ، رنگ قسمت عمودی محیط کشت تغییرکند که نشانگر بی هوازی یا بیهوازی اختیاری بودن باکتری است که بعدا در تستهای اختصاصی دیگر را روی آن انجام می دهیم.یا مثلا باکتریها فقط در قسمت شیبدار رشد می کنند و رنگ آن قسمت تغییر می کند که پی به هوازی بودن آن می برید.
روش دیگر کشت روی این محیط از محیط مایع می باشد که یک لوپ از کشت مایع باکتریایی برداشته و در سطح شیبدار بصورت زیگراک می کشید و کشت می دهید.

18. کشت باکتری در محیط کشت جامدلوله ای عمقی
    کشت باکتری در محیط کشت جامدلوله ای عمقی
Stab Culture))

19. کشت باکتری در محیط کشت جامد لوله ای شیبدار
    کشت باکتری در محیط کشت جامد لوله ای شیبدار
(Slant Culture )

20. کشت باکتری درمحیط جامد پلیت
کشت خطی(Strike method)
کشت سطحی(Spread plate)
کشت آمیخته یا پورپلیت(Pour plate)

21. کشت خطی درمحیط جامد پلیت
در این روش از محیط پیش ریخته استفاده می شود. به این ترتیب که ابتدا بوسیله یک آنس سترون شده مقداری از پرگنه باکتری را برداشته و آنرا روی سطح محیط پیش ریخته بصورت خطهای موازی و در چند جهت می کشید . در کشتهای خطی برای بدست آوردن کلنی های تک می توانید پلیت را به 4 قسمت تقسیم کنید بعد در قسمت اول ابتدا نوک آنس را که محتوی پرگنه باکتری است را بصورت خطهای موازی کشیده و بعد خطوط را در منطقه دوم از انتهای خط انتهایی منطقه اول در جهت دیگر ادامه می دهید و در منطقه سوم و چهارم هم به همین صورت عمل می کنید . خصوصیت این روش این است که وقتی خطوط موازی را روی سطح محیط می کشید به ترتیب از تراکم باکتریها کاسته می شود و به انتهای خط که می رسید تراکم باکتری کمتر است و در منطقه دیگر وقتی از انتهای خط منطقه قبلی استفاده می کنید در واقع تراکم بسیار کمتر از تراکم باکتریها در ابتدا می باشد و در نتیجه در مناطق دیگر هم به ترتیب از تعداد باکتریها کاسته می شود تا جائیکه در منطقه چهارم شما می توانید پرگنه های تکی داشته باشید که کلنی خالص نامیده می شود.
بنابراین انجام درست کشت خطی منجر به ایجاد کلنی خالص می شود این کلونی تنها از یک باکتری مادری بوجود می آید (تعریف کلنی خالص). باکتریهای  منفرد را باکتریهای مادر می نامند که این باکتریها پس از کشت خطی و جدا شدن سلولهای باکتری از یکدیگر بوجود می آیند.
توجه داشته باشید که کلنی خالص به کلنی گفته می شود که با کلنی دیگر تماس نداشته باشد.
در مورد محیطهای کشت باکتریایی که بصورت مایع می باشند برای انجام کشت خطی روی محیط پیش ریخته فقط یکبار لوپ را داخل محیط محتوی باکتری کرده و یک لوپ از آن بردارید سپس آنرا روی محیط پیش ریخته قرار داده و بصورت خطوط موازی آنرا در چند جهت بکشید.و یا مراحل فوق را روی آن انجام دهید.

22. کشت خطی درمحیط جامد پلیت

23. کشت سطحی درمحیط جامد پلیت
در این نوع کشت هم از محیط پیش ریخته استفاده می شود.
نحوه کشت :
این روش کشت بیشتر برای محیطهای مایع میکروبی کاربرد دارد و یا اگر محیط مایعی مانند شیر مشکوک به آلودگی میکروبی باشد آن را می توان به این روش کشت میکروبی داده و میکروارگانیسمهای موجود در آن را مشخص نمود.
برای اینکار ابتدا یک رقت معینی از محیط مایع تهیه نمائید. سپس با استفاده از پیپت استریل مقدار مشخصی از آن رقت را برداشته و در سطح محیط جامد پیش ریخته توسط میله پخش کننده یا توک آنس پخش نمائید. و بعد از انکوباسیون می توانید کلنی های رشد یافته در سطح محیط کشت را مشاهده کنید توجه داشته باشید که هنگام انجام کشت سطحی باید سطح محیط خشک باشد .
چون هنگام ریختن محیط کشت بصورت پیش ریخته ممکن است بخار آب روی درب پلیت و سطح محیط جمع شود برای خشک کردن آن می توان محیطها را در یک گرمخانه با دمای درجه قرار داده و خشک نمود.به این ترتیب که درب پلیت را برداشته و قسمت محتوی محیط کشت را وارونه روی لبه درب قرار دهید تا قطرات رطوبت حذف گردد.
همچنین می توانید پس از ریختن محیط کشت در پلیت در صورت تجمع حباب هوا ، آنها را با شعله دادن سطح محیط حذف نمائید. اینکار باعث سترون شدن سطح محیط کشت هم می شود.

24. کشت سطحی درمحیط جامد پلیت

25. کشت آمیخته (پورپلیت) درمحیط جامد پلیت
در این روش کشت نیاز به تهیه سوسپانسیون از باکتری می باشد . یعنی باید از باکتری مورد نظر در محیط مایع رقت معینی را تهیه نموده بعد به میزان 1 سی سی از آنرا در کف پلیت استریل ریخته سپس از محیط کشت مورد نظر که قبلا استریل شده و حرارت آن به حدود 45 درجه سانتیگراد رسیده بمیزان سی سی به پلیت اضافه نمائی. سپس با حرکات دورانی بصورت عدد 8 انگلیسی آنرا کاملا مخلوط کنید. اگر نیاز بود مجددا سطح محیط آمیخته با باکتری را با یک لایه نازکی از همان محیز کشت بپوشانید دراینحالت به آن کشت دولایه هم گفته می شود.

26. کشت آمیخته (پورپلیت) درمحیط جامد پلیت
مقایسه کشت سطحی وپورپلیت

27. کشت آنتی بیوگرام (کشت چمنی)

28. کشت آنتی بیوگرام (کشت چمنی)

29. کشت بی هوازی درجار

30. کشت بی هوازی درجار
Gas Pack Jar
Gas packs
Indicator strip

31. تقدیم به علم وحلم شما