1. التكاثر الدقيق وزراعة الأنسجة Micro Propagation and Tissue culture
يقصد بزراعة الأنسجة النمو المعقم للخلايا والأنسجة أو الأعضاء في بيئة صناعية. ثم تطور الجزء المزروع تحت ظروف محدودة من الحرارة والضوء مع وجود فيتامينات – أملاح معدنية – سكروز – مستخلص خميرة ، منظمات نمو مثل الأكسينات – السيتوكينينات – الجبريلينات ، مواد كيميائية مثل الكولشيسين ، أحماض أمينية ، مركبات عضوية – الأسبرجين – الأرجنسين – اليوريا – الجلوتامين – البيوربين .
وتعرف زراعة الأنسجة الآن بـ (التكاثر الدقيق) وتشمل زراعة الأنسجة عادة
ثلاث خطوات محدودة وهى :
إعداد مزرعة معقمة .
إكثار المادة النباتية .
إعداد وتهيئة المادة النباتية للنمو المستقل بواسطة الأقلمة والتقسية .

2. خطوات إعداد المادة النباتية

3. مميزات وأهمية تقنيات زراعة الأنسجة :
يمكن عن طريقها دراسة بعض الحقائق الهامة مثل قدرة الخلية النباتية على تخليق فرد جديد كامل.
يمكن عن طريقها معرفة دورة السيتوكينين وهو أحد الهرمونات النباتية الهامة في تكشف الخلايا النباتية.
دراسة نمو وتطور الأجزاء النباتية المختلفة بعيداً عن النبات الكامل ودون تأثير أي من العوامل الخارجية.
المحافظة على التراكيب الوراثية الجيرمبلازم عن طريق تجميد الخلايا والقمم النامية كما حدث في القرنفل والقنب بعد حفظها على درجات حرارة منخفضة -196o م .
يمكن عن طريقها نقل الأصول الوراثية لنبات أو مجموعة من النباتات من مكان لآخر في سهولة ويسر.
تقدم مزارع الأنسجة والأعضاء النباتية فكرة واضحة عن نظم تكشف هذه الأعضاء وتميز الخلايا والأنسجة المختلفة.
سرعة الحصول على الطفرات المفيدة وانتخابها ثم إكثارها بهذه الطريقة لإعطاء سلالات خضرية تمثل صنف جديد.
سهولة إجراء التهجين بين الأنواع أو الأجناس القريبة وراثياً.
يمكن عن طريق زراعة الأجنة التغلب على عدم الحصول على بذور من التهجينات بين الأنواع في الطبيعة.
يمكن عمل تهجينات خضرية أو جسمية بين الأصناف والأنواع المختلفة وأحياناً بين الأجناس مما يصعب نجاحه بطرق التربية التقليدية.
سهولة إكثار الأصناف النادرة وكذلك الطفرات المفيدة خضرياً وإنتاج سلالة منها.
يمكن عن طريق زراعة الأنسجة المرستيمية إعطاء سلالات خضرية خالية من الأمراض الفيروسية وإكثارها خضرياً لتعطى في النهاية نباتات خالية من الفيروسات.
إنتاج نباتات ثلاثية العدد الكروموسومى عن طريق زراعة الإندوسبرم.
إجراء عملية التلقيح والإخصاب الصناعي للتغلب على ظاهرة عدم التوافق وظاهرة العقم الذكرى.
إنتاج نباتات أحادية العدد الكروموسومى وذلك بواسطة:
زراعة متك الأزهار (البراعم الزهرية الغير متفتحة).
زراعة البويضات.
يمكن مضاعفة كر وموسومات النباتات الأحادية لتعطى نباتات ثنائية متماثلة

4. تنظيم معمل زراعة الأنسجة Organization of a Tissue Culture Laboratory
إن التصميم والتنظيم الأساسي لمعظم معامل زراعة الأنسجة النباتية يتضمن خمسة أماكن (وحدات) رئيسية يمكن تلخيصها فيما يلي:
مكان غسيل الزجاجيات والأدوات.
مكان تحضير وتعقيم البيئات.
مكان الزراعة تحت ظروف كاملة التعقيم.
مكان تحضين مزارع الأنسجة.
مكان المشاهدات وتجميع البيانات.

5. معمل زراعة الأنسجة النباتية

6. A media preparation area
مكان تحضير البيئات:
A media preparation area
خلط مكونات البيئة
ملء البرطمانات الزجاجية ببيئة الزراعة وتجهيزها للتعقيم في الأوتوكلاف

7. مكان الزراعة: An aseptic transfer or manipulation area
حجرة زراعة الأنسجة النباتية
أدوات الزراعة كابينة الزراعة (hood)

8. مكان التحضين: Incubator or culture room
غرفة التحضين

9. أنواع البيئات
زراعة الأنسجة لا تتم إلا في بيئات غذائية Media محتوية علي جميع العناصر المغذية سواء العناصر الكبرى أو العناصر الصغرى ثم يضاف للبيئة مجموعة الفيتامينات و السكروز و مادة الآجار و ذلك في حالة البيئات الصلبة.
و لا تضاف مادة الآجار في حالة البيئات السائلة ثم تحدد درجة الحموضة pH حسب نوع البيئة ثم يضاف الهرمون المعين أي الأوكسين أو السيتوكينين.
و أسماء البيئات الشائعة الاستعمال أسمائها علي حسب مكتشفها و هذه البيئات أعطت نتائج ناجحة و لكل بيئة تزرع نوع معين من الأنسجة.
البيئة:ف بين البيئات علي أساس التركيز لكل مكون داخل البيئة بالملليجرام في اللتر و تجهز البيئة الغذائية في المعمل تحت ظروف معقمة علي درجة 130o لمدة 15 – 20 دقيقة في المعقم.
البيئة : بمفهوم بسيط هي الوسط الغذائي الذي يستخدم في زراعة الأنسجة و التي ينمي عليها أجزاء النبات (Explants) المختلفة و المستخدمة بغرض معين.
وقد يكون الهدف هو إنتاج الكالوس (نسيج غير متميز)، أو الاستمرار حتى نحصل علي عمليات تكشف و انقسام و الحصول علي النموات الخضرية أو الجذور (Shoots or roots) أو الاستمرار حتى نحصل علي النبات الكامل، و كل نوع أو مرحلة من هذه المراحل يتطلب بيئة معينة بتركيب معلوم.

10. إكثار النبات باستخدام تقنيات زراعة الأنسجة Plant Propagation Through Tissue Culture Techniques
مرحلة الحصول علي مزرعة نسيجية معقمة .
مرحلة تضاعف الأنسجة.
مرحلة تكوين الجذور معملية و التهيئة.

11. مرحلة اختيار وإعداد النباتات الأم :
Selection and preparation of stock plants
من المعروف أن الإكثار باستخدام تقنيات زراعة الأنسجة ينتج عنه الحصول علي عدد كبير جداً من النباتات المطابقة للنبات الأم (True to type)، و من هنا تأتي أهمية هذه المرحلة في انتخاب أو اختيار النباتات الأم بحيث تكون قوية و سليمة و خالية من الأمراض حتى يكون الناتج منها بنفس الصفات، و أيضاً من المهم جداً التأكد من النوع النباتي و كذلك الصنف حتى لا يتم إكثار نبات غير مطلوب، و يمكن خلال هذه المرحلة تحديد النباتات الأم في المزرعة أو تربيتها في الصوبة إن أمكن، و يمكن وضع برنامج متابعة لهذه النباتات للتأكد من صفاتها و نشاطها و بحيث تكون جاهزة لأخذ الأجزاء النباتية منها في الموعد المناسب لطبيعة النبات و برنامج الإكثار، لأنه من المهم معرفة الحالة الفسيولوجية للنبات الأم و كذلك أفضل موعد لفصل الأجزاء النباتية، و في هذه المرحلة يمكن أيضاً تحديد الصفات الوراثية للنبات الأم من خلال البصمة الوراثية (Finger print) و مطابقتها فيما بعد بالبصمة الوراثية للنباتات الناتجة في المعمل.

12. مرحلة الحصول علي مزرعة نسيجية معقمة:
Establishment of an aseptic culture
إن نجاح أي برنامج لإكثار النباتات باستخدام زراعة الأنسجة يعتمد بصفة أساسية علي اختيار الجزء النباتي المناسب، و يمكن استخدام أي نسيج أو عضو نباتي في إكثار النباتات، إلا أن نسبة النجاح تتوقف علي أسلوب الزراعة و النوع النباتي المستخدم و أيضاً علي كفاءة التخلص من الملوثات السطحية (Surface contaminants) الموجودة علي الجزء النباتي المراد زراعته، و تعتبر عملية التخلص من الملوثات من الأمور الهامة جداً لصعوبة تحقيق التوازن بين التخلص نهائياً من الكائنات الحية مع المحافظة علي حيوية الجزء النباتي في نفس الوقت.
الهدف الرئيسي لهذه المرحلة هو الحصول علي مزرعة نسيجية تحتوي علي الجزء النباتي المفصول من النبات الأم بصورة معقمة و بحيث لا يحتوي هذا الجزء علي أي ملوثات مرضية (Pathogens free) و محتفظاً بحيويته و التي تمكنه من النمو في هذه المرحلة ثم التطور في المراحل التالية، و تتضمن هذه المرحلة عملية تجهيز و فصل الجزء النباتي من النبات الأم، ثم غسيل الجزء النباتي بالماء الجاري لفترة تتراوح بين ساعة و عدة ساعات وفقاً لمصدر النبات الأم و طبيعة التربة و البيئة النامي فيها، ثم ينقل الجزء النباتي للتعقيم تحت الظروف كاملة التعقيم بغرض التخلص تماما ً من أي ملوثات موجودة علي السطح الخارجي، و في معظم الأحيان يتم التعقيم السطحي باستخدام محلول (10 – 50%) كلوراكس لمدة من 10 – 30 دقيقة، و بعدها يشطف الجزء النباتي عدة مرات بالماء المقطر المعقم، و بعد ذلك يتم تصغير حجم الجزء النباتي إلي الحجم المطلوب ثم الزراعة علي البيئة المناسبة تحت الظروف كاملة التعقيم، و هذه المرحلة تتضمن أيضاً بعض العمليات أو المعالجات الخاصة، فمثلاً بعض الأجزاء النباتية تتلون بسرعة باللون البني (Browning) أثناء عملية التصغير أو التقطيع داخل كابينة الزراعة و هذا يؤثر بالتالي علي نسبة نجاح المزرعة، و في هذه الحالة يتم معالجة الجزء النباتي المفصول و المراد زراعته ببعض المواد المضادة للأكسدة (Anti oxidants) قبل التعقيم داخل كابينة الزراعة.

13. Multiplication of the tissue
مرحلة تضاعف الأنسجة:
Multiplication of the tissue
تهدف هذه المرحلة إلي الحصول علي عملية التضاعف السريع لتجمعات البراعم و الخلايا (Propagules) و التي تكونت نتيجة لاستجابة الجزء النباتي بعد نقله من البيئة السابقة إلي بيئة التضاعف، و عملية نقل الجزء النباتي ثم تجمعات البراعم تتم بإعادة الزراعة (Subculturing) علي البيئة الجديدة، وتؤدي في النهاية إلي تكوين نموات خضرية (Shoots) أو نباتات كاملة (Plantlets) جديدة، وعموماً فإن عملية التضاعف والحصول على مجموعة من النباتات المتماثلة الناتجة من نبات واحد والتي يطلق عليها اسم السلالة أو الكلون (Clone) وبتعبير آخر فإن عملية التكاثر الكلونى (Clona Propagation) أو عملية التضاعف الكلونى (Clonal multiplication)

14. Somatic Embryogenesis
تكوين الأجنة الجسدية:
Somatic Embryogenesis
تعتمد طريقة تكوين الأجنة على نظرية القدرة الكامنة للخلية والتي تعنى قابلية أي خلية حية لتكوين نبات كامل، وتعتبر طريقة تكوين الأجنة الجسدية ذات قدرة هائلة في تحقيق التكاثر الكلونى نظراً للأعداد الهائلة من الأجنة التي تتكون خلالها، وذلك لأن كل خلية منفردة تتحول إلى جنين له نفس التركيب الوراثى للنبات الأم مصدر الخلايا، ونظراً لأهمية هذه الطريقة في الحصول على العديد من النباتات من نسيج أو تجمع خلوي محدود وفي زمن محدد – جرام من كالوس الجزر أعطى 500 نبات خلال شهر واحد – فقد استخدمت هذه الطريقة في إكثار العديد من النباتات، وعموماً يمكن الحصول على الأجنة الجسدية من مزارع الكالوس (Callus cultures) وغالباً من مزارع الخلايا المعلقة (Cell suspension cultures)، والأخيرة هي الأكثر شيوعاً والأسهل في الحصول على الأجنة الجسدية.
أجنه جسدية نشأت على ورقه فلقيه لنبات الكاسيا نودوزا

15. التضاعف عن طريق تكوين الأفرع الإبطية
تنشيط البراعم الإبطية:
Enhancement of axillary buds
تعتمد هذه الطريقة على تنشيط كلاً من البراعم الإبطية (Axillary buds) والبراعم الطرفية (Terminal buds) الموجودة على الجزء النباتي والتي تعطى العديد من الأفرع الخضرية، وإذا احتوى الجزء النباتي على برعم واحد فإن هذا البرعم يمكن أن ينمو ويعطى فرع خضري واحد أو عدة أفرع خضرية وذلك بناءاً على النوع النباتي وبيئة الزراعة وما تحتويه من مكونات خاصة منظمات النمو النباتية، الأفرع الخضرية الناتجة يعاد زراعتها مرة أخرى على بيئة التضاعف وتكون هذه الأفرع منفردة أو في تجمعات فتنشط البراعم الإبطية لكل فرع خضري وتعطى العديد من الأفرع الخضرية الجديدة طالما توفرت الظروف المناسبة، وهكذا بتكرار إعادة زراعة الأفرع الناتجة يتم الحصول على أعداد هائلة من النموات الخضرية والتي تكون جاهزة للنقل للمرحلة التالية لتكوين الجذور عليها، وجدير بالذكر أن عملية إعادة الزراعة
التضاعف عن طريق تكوين الأفرع الإبطية

16. تكوين أفرع عرضيه على ورقه نبات الجربيرا
تكوين الأفرع الخضرية العرضية:
Adventitious shoot development
تعرف النموات أو الأفرع الخضرية العرضية بأنها النموات التي تظهر على الأنسجة في مواقع غير البراعم الإبطية أو القمم الساقية، ومن هنا فإن النموات العرضية مثل الأفرع الخضرية
تكوين أفرع عرضيه على ورقه نبات الجربيرا

17. مرحلة تكوين الجذور معملياً والتهيئة: In vitro rooting and conditioning
تهدف هذه المرحلة إلى تكوين الجذور معملياً على الأفرع الخضرية التي تكونت في المرحلة السابقة من مراحل الإكثار ، ويتم ذلك بنقل الأفرع الخضرية من بيئة التضاعف والتي تحتوى غالباً على أحد السيتوكينينات إلى بيئة تكوين الجذور والتي تحتوى غالباً على أحد الأوكسينات أو تكون خالية تماماً من منظمات النمو النباتية ونظراً لأهمية عملية تكوين الجذور على الأفرع الخضرية في المعمل فقد درس المهتمون بالمجال العديد من العوامل والظروف التي تؤدى إلى تكوين الجذور بكميات كافية خاصة في الأنواع النباتية الصعبة في تكوين الجذور ، وعموماً فإن هذه المرحلة تستغرق حوالي 2-4 أسابيع ويتم فيها تكوين الجذور وتهيئة النباتات جزئياً ، وهذا الأسلوب يتم إتباعه في العديد من المعامل خاصة على المستوى التجاري ، إلا أنه في بعض الأحيان تتكون الجذور على الأفرع الخضرية لبعض الأنواع النباتية خلال مرحلة التضاعف السابقة ودون النقل إلى مرحلة تكوين الجذور ، ويرجع ذلك أساساً إلى إختلال المحتوى الهرموني الداخلي للأفرع الخضرية وكذلك التأخير في عملية النقل من بيئة التضاعف إلى بيئة تكوين الجذور ، ومن أكثر الأوكسينات إستخداماً في عملية تكوين الجذور معملياً نفتالين حمض الخليك (NAA) وإندول حمض البيوتريك (IBA) وبتركيزات تتراوح بين 0.05 – 3.0 ملليجرام/لتر، ومن المعروف أن استجابة الأفرع أو النموات الخضرية لتكوين الجذور عليها تتوقف لحد كبير على النوع النباتي، ومن الشائع استخدام بيئة تجذير تحتوى على نصف مكوناتها من الأملاح بمعنى استخدام نصف تركيز العناصر الكبرى والصغرى لبيئة الزراعة، واستخدام بيئة الزراعة بهذا التركيز المنخفض من الأملاح يكون مناسباً لعدم حاجة النباتات إلى قدر كبير من النتروجين في هذه المرحلة، ويمكن أن تؤثر الظروف البيئية للزراعة على تكوين الجذور معملياً، فمن المعروف أن الشعيرات الجذرية لا تتكون بصورة طبيعية على الجذور المتكونة على البيئات الصلبة ويرجع ذلك إلى سوء التهوية، في بعض الأنواع النباتية يؤدى تعرض المزارع للضوء في هذه المرحلة إلى تقليل معدل تكوين الجذور وقد يمنع تكوينها، وفي بعض الأنواع الأخرى يكون تعرض المزارع لفترة إضاءة قصيرة يتبعها التعرض للضوء مع وجود الأوكسين في البيئة مهماً لتكوين الجذور.

18. تكوين الجذور داخل المعمل

19. تكوين الجذور خارج المعمل والأقلمة:
In vitro rooting and acclimatization
تعرف الأقلمة بأنها عملية تهيئة أو تكييف النباتات للتغيرات البيئية، وهذه العملية مهمة للنباتات الناتجة من زراعة الأنسجة (Transplants) والتي تكون غير مهيئة لتحمل الظروف البيئية الخارجية، ومن المعروف أن النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة تكون حساسة جداً نظراً لنموها وتطورها في مزارع ذات طبيعة خاصة تتوفر فيها كل احتياجات النبات، و من ناحية أخري فإن عملية التمثيل الضوئي في مزارع الأنسجة تتم بمعدلات ضئيلة جداً مقارنة بالنبات النامي في الخارج (In vivo)، و لذلك تحتاج نباتات زراعة الأنسجة إلي فترة أقلمة حتى يمكنها النمو في الصوب ثم الحقل بدون أي مشاكل وخلال فترة الأقلمة يعتمد النبات على ذاته لحد ما ويتم تشجيع عملية التمثيل الضوئي وكذلك تنشيط تكوين الطبقة الشمعية وبالتالي تقليل فقد الماء من النباتات، وفي بعض الأنواع النباتية يتم نقل الأفرع الخضرية من المزارع إلى مخلوط من التربة الصناعية لتكوين الجذور عليها خارج مزارع الأنسجة ثم أقلمتها، أو يتم نقل النباتات الكاملة من مزارع الأنسجة وزراعتها (Transplanting) في مخلوط التربة الصناعية بغرض الأقلمة، ومخلوط التربة (Soil mixture) يمكن أن يطلق عليه أحياناً اسم مخلوط التجذير (Rooting mixture) وهذا المخلوط يشمل بعض المواد مثل البيت موس، بارك، برليت، فرميكيوليت والرمل، ويجب مراعاة موضوع الحموضة أو القلوية في التربة الصناعية المستخدم في عملية الأقلمة، على سبيل المثال ربما يكون البيت موس حامضي جداً لعملية التجذير في بعض الأنواع النباتية بينما يكون الفرميكيوليت أكثر قلوية، عموماً فإن مخلوط التجذير المناسب للعديد من النباتات يكون متعادلاً أو مائل قليلاً للحموضة حيث تتوفر أعلى درجات الرطوبة مع وجود الصرف والتهوية.

20. أقلمة النباتات داخل الصوبة

21. مزارع الأعضاء النباتية: (الأعضاء الخضرية أو الأعضاء التكاثرية)
أنواع المزارع
مزارع الأعضاء النباتية: (الأعضاء الخضرية أو الأعضاء التكاثرية)
وهى عبارة عن أعضاء نباتية أمكن فصلها من النبات الأم وهى تشمل كلا من قمم الأفرخ الخضرية – قمم الجذور – مبادىء الأوراق – مبادىء الإزهار – مبادىء الأجزاء الزهرية غير مكتملة النمو – الثمار غير مكتملة النمو.
رسم تخطيطي يوضح الأجزاء النباتية المختلفة التي يمكن زراعتها معمليا

22. رسم تخطيطي يوضح تكوين أفرع من زراعه الكالس
مزارع الكلس:
Callus Cultures
وهى عبارة عن أنسجة تنشأ من الخلايا التي تستعيد نشاطها للأجزاء النباتية المفصولة من الأعضاء النباتية وتنمى أنسجة الكلس عادة كتلة من الخلايا على بيئات صلبة.
رسم تخطيطي يوضح تكوين أفرع من زراعه الكالس

23. خطوات زراعة الجذور معملي لنبات الجزر
الجذور: Roots
تعد الجذور من المصادر الهامة للعديد من الأجزاء النباتية، ولقد كان للجذور المفصولة دوراً هاماً في تاريخ زراعة الأنسجة. ففي عام 1934 تمكن White من زراعة جذوراً مفصولة لنبات الطماطم وذلك في بيئة سائلة تحتوى على أملاح معدنية – سكروز – مستخلص خميرة.
خطوات زراعة الجذور معملي لنبات الجزر

24. إكثار نبات البيجونيا معمليا بواسطة تقسيم الأوراق
الأوراق:
Leaves
تفصل الورقة أو جزء من الورقة وتعقم ثم توضع في بيئة آجار لتظل محتفظة بنضارتها لفترة طويلة ونظراً لأن مقدرة الورقة على النمو محدودة فإن كمية نموها يتوقف على مرحلة النضج التي تؤخذ من على النبات الأم، الأوراق الصغيرة أعلى مقدرة على النمو من الأوراق الكبيرة.
إكثار نبات البيجونيا معمليا بواسطة تقسيم الأوراق

25. المتك وحبوب اللقاح: Anthers and Pollens
مراحل زراعة حبوب اللقاح

26. خطوات الفصل الأجنة وزراعتها:
تزال أغلفة البذور بعد غمرها في الماء حتى يمكن سهولة الفصل.
غمر البذور في الماء لمدة 24 ساعة بعد إزالة الأغلفة.
تفصل الأجنة مع ملاحظة عدم الإضرار بها أثناء عملية الفصل.
توضع الأجنة في أطباق بترى معقمة تحتوى على البيئة المغذية بحيث لا يقل المسافة بين الجنين والآخر20 مم.
وضع الأطباق في حضانات على درجة حرارة 20oم و 8 ساعات يومياً إضاءة لمدة 2-4 أيام.
يبدأ نمو الأجنة مع متابعتها يومياً لإزالة أي عفن منها (الأجنة الميتة تجف وتتلون باللون الأسود).
بعد 14 يوم تكون البادرات في حالة تسمح بنقلها لأواني خاصة محتويه على بيئة ملائمة.
توضع الأواني وبها البادرات في بيئة تحتوى على رطوبة مناسبة حتى يتم تكوين الأوراق الأولى تماماً.
تنقل النباتات إلى صوب بلاستيكية لمدة شهرين ثم تنقل تدريجياً إلى الحقل.

27. الإكثار الدقيق لنخيل جوز الهند باستخدام الأجنة الجنسية

28. إكثار نبات الهاورثيا بزراعة الكالس

29. طرق فصل البروتوبلاست:
قدم كوكنج في عام 1960 أكثر الطرق فاعلية في فصل البروتوبلاست وتعتمد على استخدام إنزيمات محللة لجدر الخلايا. وأكثر الإنزيمات استخداما لهذا الغرض السليوليز – الهيميسليوليز – البكتينيز.
وهناك عدة طرق تستخدم حالياً لفصل البروتوبلاست من أنسجة مختلفة أوراق – حبوب لقاح – كلس – معلق الخلايا.

30. طرق زراعة معلق الخلايا أ - المزارع بطيئة التردد (الأوراق) .
المزارع المستمرة
المزارع المجزأة د ج ب أ
أ - المزارع بطيئة التردد (الأوراق) .
ب- المزارع المهتزة .
جـ- المزارع الدوارة .
د - Stirred cultures .

31. Bathe cultures المزارع المجزأة
عبارة عن نظام مغلق توضع فيه الخلايا لتنمو فى حجم محدد من البيئة التى ترج حتى يتم توزيع الخلايا المفردة .
حتى لا توجد فى تجمعات ولكى تشجع تبادل الغازات مع الهواء .
زيادة عدد الخلايا فى مدة قصيرة من الزمن يقل محتوى البيئة من العناصر الغذائية
تعمل على زيادة عدد الخلايا فى البيئة الجديدة وبذلك يمكن للمزرعة الإستمرار والتكاثر عن طريق نقلها كل فترة زمنية إلى بيئة جديدة وذلك بواسطة ماصات أو سرنجات

32. طرز المزارع المجزأة
المزارع بطيئة الدوران
يستخدم فى هذا الطراز دوارق خاصة سعة 250 ملل لزراعة الخلايا المفردة وتجمعات الخلايا المفصولة من أجزاء النبات المستخدم وليكن الجذر
البيئة المهتزة
يستخدم هذا النظام لتهيئة معلق خلايا نبات الدخان
المزارع الدوارة
تتكون هذه المزرعة من زجاجة كبيرة سعة 10 لتر (يوضع بها 4.5 لتر من البيئة) وتوضع فى إطار صلب الذى يثبت فى وضع مائل بزاوية 45oم بحيث يكون لها القدرة على الدوران .
Stirred cultures
فى هذا النوع من المزارع نجد أن تبادل الغازات يتم من خلال دفع فقاعات الهواء خلال البيئة

33. نظم المزارع المستمرة أهم خصائص هذه المزرعة يضبط الكثافة الضوئية .
يتركب هذا النظام من قارورة كبيرة مع إمدادها بالبيئة المغذية عن طريق مضخة التى تعمل على إحلال حجم من البيئة مساوياً للحجم المزاح من المزرعة
أهم خصائص هذه المزرعة
ضبط معدل النمو بحيث يكون معدل إنتاج الخلايا الجديدة مساوياً لمعدل الخلايا المزاحة من البيئة .
ثبات المزرعة متمثلة فى ثبات كثافة الخلايا ومعدل النمو والمحتويات الكيماوية.
يضبط الكثافة الضوئية .
يضبط درجة حموضة الوسط pH ذاتياً مع تثبيت الحالات الفسيولوجية .

34. نمو الخلايا المفردة The growth of single cells
وهناك ثلاث طرق أساسية لزراعة الخلايا المفردة وهى :
ِA- The paper raft nurse technique :
أخذ خلية مفردة من نسيج الكلس أو معلق الخلايا بواسطة إبرة دقيقة .
وضع الخلية فوق سطح ورقة ترشيح ملامسة للمحلول (البيئة المغذية) وهذه الطريقة تمد الخلية المفردة المنزرعة بعوامل النمو المختلفة التى تقوم البيئة بتوفيرها .
تنقسم الخلية عدة إنقسامات لتعطى مستعمرة خلوية التى يعاد زراعة كل جزء على بيئة جديدة لإعطاء نسيج كلس ، ويعرف الكلس الناتج عن الخلية المفردة بإسم مستعمرة خلوية مفردة .
عندما تبلغ المستعمرة حجماً مناسباً تنقل إلى بيئة أخرى طازجة حيث تعطى سلالة ناتجة من خلية مفردة .

35. نمو الخلايا المفردة The growth of single cells
B- The petri dish plating technique :
الخطوات :
ترشيح معلق الخلايا لإزالة التجمعات الكبيرة من الخلايا .
تعقيم بيئة آجار وتركها فترة لتبرد حتى تصل درجة حرارتها 35oم وهى درجة سائلة للآجار غير قاتلة للخلايا .
خلط معلق الخلايا مع البيئة السابقة .
يصب الخليط فى أطباق بترى لعمل طبقة سمكها 1 مم .
بعد 21 يوم وعلى درجة 25 oم (فى حضانة + الظلام) يبدأ ظهور المستعمرات التى تستخدم فى تنشيط السلالات الناتجة عن الخلايا المفردة .
يتم عد الخلايا بعد 21 يوم على درجة 25 oم ويتم عد المستعمرات المتكونة بكل طريقة ويحسب كالتالى :
عدد المستعمرات فى الطبق
Planting efficiency =
عدد وحدات الخلايا فى الطبق
C- Growth of cells in micro-chambers

36. التطبيقات علي إستخدام زراعة القمة النامية
التكاثر الدقيق : Micro propagation
إستخدام طريقة التكاثر الدقيق تعد الآن أفضل الطرق المألوفة للتكاثر الخضري و ذلك للميزات الآتية:-
صغر الجزء المستخدم في الإكثار و تكوين ملايين النباتات في العام الواحد
العديد من النباتات لا يمكن إكثاره بالطرق العادية و تكون البديل الوحيد هو زراعتها معملياً مثل كثير من أشجار الغابات.
سهولة تداولها بين الدول نتيجة لسهولة إجراء الحجر الزراعي .
الرصيد المعملي من النباتات يمكن إنتاج شتلات منه في أي وقت من السنة .

37. التطبيقات علي استخدام زراعة القمة النامية
يحدث التكاثر بإحدى الطرق الثلاثة :
تحفيز البراعم الإبطية (تفريع جانبي).
إنتاج أفرع عرضية عن طريق التكوين العضويOrganogensis .
من خلال تكوين الأجنة الخضرية Somatic embryogenesis .
مميزات و عيوب كل طريقة
تحفيز البراعم الإبطية لها ميزة هامة وهي أن الجزء المستخدم هو بداية فرع متميز داخل الجسم الحي أي ثابت وراثياً و لا يمكن أن يحدث له أي تغيرات .
التكوين العضوي Organogensis و التكوين الجيني Embryogenesis يخضع لتغيرات في مراحل النمو و التطور
أما النباتات الناتجة من زراعة المرستيم و القمة النامية و البراعم عادة تكون متماثلة و تظهر حالة من الثبات الوراثي للنباتات الناتجة .

38. التطبيقات علي استخدام زراعة القمة النامية
قواعد نجاح هذا التكنيك(إكثار الأوركيد) من خلال تقسيمه مراحل الإكثار إلي ثلاثة مراحل:
الوصول إلي زراعة في وسط معقم Establishment .
تضاعف و زيادة الجزء النباتي .
التحذير و التقسية و النقل إلي التربة .
يوجد العديد من المحاصيل البستانية يتكاثر بهذه الطريقة تجارياً مثل :
– الأتنوريم – الجلاديوس
– الكريزانثم – البصل
– القرنفل – الفجل
– الجربيرا، – البنجر
– الفاصوليا. – الكرنب

39. التطبيقات علي استخدام زراعة القمة النامية
دراسات فسيولوجية
دراسة نمو البراعم علي نبات كامل لا يسمح بعزل العوامل الفسيولوجية الدقيقة التي تؤثر في نمو البراعم .
بينما فصل البراعم و زراعتها معملياً تعطي توضيح دقيق لعوامل النمو الخاصة بالبرعم فقط دون تأثير الأجزاء النباتية الأخرى المرتبطة بالبرعم علي النبات.
ساعدت زراعة البراعم المفصولة معملياً في توضيح دقيق لدور منظمات النمو في البراعم و تطورها فبعد معرفة دور قمة الجذر في تخليق السيتوكيتين
ثبت أن قمة ساق نبات الإسبرجس إستمرت في نشر كمية قليلة و لكن بصورة مستمرة من السيتوكينين داخل بيئة الزراعة خلال 5 مرات من الزراعة الثانوية .

40. التطبيقات علي إستخدام زراعة القمة النامية
حفظ الجيرمبلازم
الجينوم – التركيب الوراثي أو الدم الوراثي – مربي النبات يهمه المحافظة عليه لضمان وجودها في أي وقت من السنة .
الأنواع التي تتكاثر جينياً تسهل المحافظة علي الجينوم في صورة بذور .
حفظ الجينوم للأنواع التي تتكاثر خضرياً فهو أمر مكلف جداً حيث يتطلب تواجد الجيرمبلازم نامياً علي الدوام.
تفكير مربي النبات نحو مزارع الأنسجة لحفظ سلالات و أصناف الأنواع الخضرية التكاثر و هو ما يحقق المزايا التالية :
حفظ أعداد كبيرة من السلالات في مساحة صغيرة بالمختبر.
بقاء السلالات المخزنة خالية من جميع الكائنات الممرضة خاصة الفيروسية.
يمكن إستخدامها في إنتاج عدد كبير من النباتات في أي وقت من السنة.
سهولة تداولها بين الدول.

41. التطبيقات علي استخدام زراعة القمة النامية
الحفظ بالتجميد : Cryo preservation
إمكانية حفظ المرستيمات و البراعم علي درجة التجميد مثل النيتروجين السائل - 196o م
يفضل حفظ الجيرمبلازم علي هيئة مرستيمات و قمة نامية عن معلق الخلايا والكلس وذلك لـ :
تجنب التغيرات الوراثية الكبيرة التي يمكن أن تحدث لمزارع الكلس.
تحتفظ بقدرتها علي إستمرار النمو خلال فترة التخزين (لا تفقد قابليتها للنمو).
بينما مزارع الخلية تفقد القابلية للنمو أي تفقد خاصية To Tipo Tency .
يمكن تخزين مرستيمات النباتات الأحادية كما هي دون فقد للحالة الأحادية .
الخلايا المرستيمية (خصائصها) أكثر قدرة علي تحمل عملية التجميد و الإذابة.

42. التطبيقات علي استخدام زراعة القمة النامية
فقد وجد :-
أن المعاملات بالبرودة للنبات (الأم) الذي سيؤخذ منه القمم المرستيمية علي 4o م لمدة 3 أيام أو أكثر قبل إستئصال المرستيم منه تؤدي هذه المعاملة إلي مضاعفة فترة بقاؤها حية بعد التجميد و زيادة 7 مرات في عدد الأفرع الناتجة .

43. التطبيقات علي استخدام زراعة القمة النامية
التخزين بالتبريد
يمكن تخزين المرستيمات في درجة حرارة منخفضة تتراوح بين °م و يعمل في هذا المجال الحراري علي إبطاء تدهور النسيج النباتي ولا يمنعه.
يعني ذلك إعادة زراعة النسيج و لكن علي فترات متباعدة .
75 Morel تمكن من حفظ قمم العنب علي درجة 9 °م مع تغيرها كل عام .
79 Lundergan خزن قمة التفاح علي درجة 1- 4°م إلي أقل من سنة مع عدم فقد القدرة علي النمو.

44. التطبيقات علي استخدام زراعة القمة النامية
استئصال المرض Disease elimination
الهدف من زراعة القمة المرستيمية لنبات مصاب هو الحصول علي أعداد قليلة من هذه النباتات خالية من الأمراض الفيروسية
عند إجراء التكاثر الخضري لنبات مصاب ينتقل المرض من جيل لآخر خلال هذا التكاثر ، حتي النباتات السليمة (ظاهرياً) قد تكون حاملة للمرض ولا تظهر الأعراض إلا بعد أجيال من التكاثر الخضري .
من الصعب إكتشاف الأعراض ولكن المحصول أو الجودة أو كلاهما تقل تدريجياً .
ودور مزارع القمم المرستيمية هو إنتاج نباتات خالية من الأمراض الفيروسية و يعد ذلك أمراً بالغ الأهمية في المحاصيل التي تكاثر خضرياً .
قمة الساق أو قمة الجذر للنباتات المصابة بالفيروسات تكون خالية أو تحتوي علي كمية قليلة جداً من الفيروس
المعالجة بالطرق الكيميائية أو الطبيعية (مثل الحرارة) نجاحها محدود في إستئصال الأمراض الفيروسية من النباتات المصابة.

45. Micro grafting إنتاج الشتلات من البذور (الأصل) :
تقشر البذور بعد تعقيمها بهيبوكلوريت الصوديوم .
تؤخذ الشتلات علي عمر أسبوعين.
وتقطع القمة بعد 1.5 سم من العقدة الفلقية .
ويقصر الجذر إلي 4 – 6 سم .
عمل حز التطعيم (حرف T) .

46. Micro grafting التطعيم و العناية بالشتلات : تحضير الطعم :
يستخدم الطعم من النموات الخضرية الغضة النامية في الحقل أو الصوب
تزال الأوراق الكبيرة من علي الجزء النباتي وتقصر إلي طول 1 سم ثم تعقم بهيبوكلوريت الصوديوم
تزال الأوراق الصغيرة المتبقية تحت الميكروسكوب المعقم
التطعيم و العناية بالشتلات :
توضع القمة داخل الجرح (الحز T)من الأصل بحيث يلامس اللحاء للداخل و تزرع في بيئة جديدة و تحضن حتي نجاح التطعيم .