1. Fundamentals in Spectroscopy (in Biology)
Dr. Lital Alfonta

2. בהרצאה זו: מבוא לספקטרוסקפיה ספקטרא אלקטרוני
ויברציות במאקרומולקולות – IR וראמאן
תהודה מגנטית גרעינית NMR ויישומיה בביולוגיה
קריאה מומלצת: Spectroscopy for the Biological Sciences; Gordon G. Hammes , Wiley-Interscience 2005

3. מהי ספקטרוסקופיה? ספקטרוסקופיה היא הקשר בין חומר לקרינה
קשר המוגדר על ידי משוואת פלנק:
E=hn=hc/l
– קרינה מוגדרת על ידי אנרגיה
n– תדירות
l- אורך גל
c- מהירות האור 2.998x1010 cm/s
h- קבוע פלנק, 6.625x10-34 J.sec

4. אורכי הגל הרלוונטיים בתופעות של קרינה אלקטרומגנטית
                      
Color?
אורכי הגל הרלוונטיים בתופעות של קרינה אלקטרומגנטית

7. רמות אנרגיה מולקולריות

8. מושגי יסוד
שדה אלקטרומגנטי – שדה פיסיקלי הנוצר על ידי עצמים טעונים חשמלית. הוא משפיע על עצמים טעונים המצויים בקירבתו.
אורך גל- המרחק בין יחידות חוזרות של גל מתקדם בתדירות נתונה, מאופיין על ידי פונקציה סינוסואידלית.
אמפליטודה – גובה הגל, במחצית המרחק האנכי בין השיאים
מכניקת קוונטים – חקר הקשר בין מנות אנרגיה (קוונטות) לבין החומר. במיוחד בין אלקטרוני הערכיות באטום לבין פוטונים.
חלקיק בקופסא
תכונות של גלים

9. ספקטרא אלקטרוני

10. מיכשור ספקטרופוטומטר: פוטומולטיפלייר פריזמה I0 I מקור אור גלאי
מונוכרומטור
דוגמא
Beer-Lambert law:
Log (I0/I)=A=ecl

11. מה ניתן ללמוד בעזרת ספקטרוסקופיה אלקטרונית?
ריכוזים
קינטיקה וקבועי קישור
מעברי אלקטרון
מצב חמצון
מרחקים בין אטומים
קיפול/ אי קיפול של חלבון
מבנה של חלבון

12. בליעות אופייניות של מולקולות ביולוגיות
חלבונים:

13. DNA:

14. קבוצות פרוסטטיות
FAD
oxi and deoxy hemoglobin

15. ספקטרוסקופיית בליעת קרני X
האנרגיה הקשורה ב-קרן X באורך גל של 1Å הינה 106 kJ/mole
זו אנרגיה המספיקה להוצאת אלקטרון מאורביטלים פנימיים.
אם האטום המעורר מוקף באטומים אחרים, שכנים, האלקטרון יתנגש בסביבתו.
הדבר יגרום לתנודות סביב הפיק הראשי כתוצאה מהחזרת הפיזור ויתן ספקטרא למבנים מאוד מורכבים.
השיטה יעילה במיוחד לאנליזה של מבנים ביולוגיים המסודרים סביב מתכות כבדות.

16. X ray diffraction of myoglobin

17. פלואורסנציה ופוספורסנציה
דיאגרמת רמות אנרגיה (דיאגרמת יבלונסקי):
האלקטרונים מעוררים ממצב היסוד, S0, לרמות ויברציוניות שונות ברמה אנרגטית גבוהה יותר, S1.
כל האלקטרונים מזווגים במצב הסינגלט, הספינים בכיוונים מנוגדים.
דעיכה אל קרינתית מתרחשת אל הרמה הויברציונית היסודית של המצב האנרגטי המעורר, S1.
כאשר האלקטרונים חוזרים למצב האלקטרוני היסודי, מתקבלת פלואורסנציה.
במקרים מסוימים עוברים האלקטרונים למצב טריפלט, T1, מעבר אל-קרינתי.
מצבי טריפלט מאופיינים בשני אלקטרונים בלתי מזווגים.
האלקטרונים במצב הטריפלט יכולים לחזור למצב היסוד האלקטרוני תוך כדי פוספורסנציה.

18. המצב הטריפלטי המעורר נמוך יותר באנרגיה מהמצב הסינגלטי המעורר, ולכן אורך הגל של הפוספורסנציה גבוה מאורך הגל של הפלואורסנציה.
זמן החיים של טריפלט הוא ננו-שניות
בטריפלט, כדי לדעוך למצב היסוד יש להחליף גם את הספין. האפשרות ששני ארועים אלו יקרו נמוכה יותר, ולכן זמן החיים ארוך הרבה יותר.
פלואורוסנציה
פוספורסנציה

19. חומרים פלואורסנטים/פוספורסנטים מתאפיינים ברגישות גבוהה לסביבה, יתרונם על פני חומרים בולעי אור הוא רגישות החישה שלהם, דרושים ריכוזים מאוד נמוכים מהם לצורך קבלת סיגנל
Quantum yield

20. FRET (Fluorescence Energy Transfer)
סרגל מולקולארי
תלות יעילות העברת האנרגיה במרחק בין D ל A:

21. FRET process can provide very sensitive measurements on the separation distance of the donor and acceptor labeled molecules.  Donor and acceptor molecules must be in close proximity typically, (10–100 Å)
These interaction distances can be measured using this approach when FRET is used for: co-localization of proteins, DNA and other molecules.

22. Single Molecule FRET Individual receptors diffusing in the plane
of the membrane of a living cell.

23. ויברציות במקרומולקולות, ספקטרוסקופיה מולקולארית

24. IR and Raman spectroscopy “the Infra Red Zone”

27. A Genetically Encoded Infra red Probe
Kathryn C. Schultz, et. al, JACS,2006

28. סולפונציה של אלגינט:
Freeman I., Kedem A., Cohen S., Biomaterials,2008

29. ספקטרום ה NMR והIR עבור אלגינט סולפאט:
Freeman I., Kedem A., Cohen S., Biomaterials,2008

30. שיטות
FTIR – קרן האור מפוצלת לשניים, מחצית מהאור עוברת דרך הדוגמא. הפרש הפאזות בין הגלים יוצר התאבכות בונה או הורסת אשר מהווה מדד לבליעה על ידי הדוגמא. הגלים נסרקים במהירות באזור סמוך לאורץ גל מסוים בספקטרא, ריבוי הסריקות נאספות לקבלת ספקטרום שהינו ממוצע הספקטרא.
ספקטרוסקופיית ראמאן – בעוד IR מבוסס על בליעה של מעברים בין אנרגיות ויברציה, ראמאן מבוסס על תכונת פיזור האור. כמות האור המפוזר הנאסף ב- 90o לכוון האור המוקרן. הפיזור נקרא פיזור Rayleigh.

31. Raman of Mb
ספקטרא ראמאן של מיוגלובין ניתן לקבל גם עבור ריכוזים נמוכים מאוד וללמוד על מצב החימצון של הברזל, כמו גם על הקואורדינציה שלו ועל אופי המולקולה הקשורה לפורפרין.
באופן דומה ניתן לנצל ראמאן לחקור חלבונים ומנגנונים המערבים קו-פקטרום שונים דוגמת : NADPH ו FAD.

32. NMR-תהודה מגנטית גרעינית
Kurt Wüthrich
The Nobel Prize in Chemistry 2002
ETH Switzerland
The Scripps Research Institute, CA
"for his development of nuclear magnetic
resonance spectroscopy for determining
the three-dimensional structure of biological
macromolecules in solution"

33. מה מוביל לתופעה-.... A spinning charge generates a magnetic field
The resulting spin-magnet has a magnetic moment )μ (proportional to the spin.
In the presence of an external magnetic field (B0), two spin states exist, +1/2 and -1/2.
The difference in energy between the two spin states is dependent on the external magnetic field strength, and is always very small.
The following diagram illustrates that the two spin states have the same energy when the external field is zero, but diverge as the field increases.

34. A Spinning Charge in a Magnetic Field

36. האינפורמציה אותה ניתן לחלץ מספקטרום :NMR
1. היסט כימי
שימו לב: זהו
NMR של פרוטונים!

37. 2. עוצמת הסיגנל: מספר הפרוטונים עם סביבה זהה.

38. 3. אינטראקציות ספין-ספין או "תאמר לי מי שכניך ואומר לך מי אתה" ולהפך:
1,2-dichloroethane
1,1-dichloroethane
N+1 rule

40. NMR דו מימדי COSY & NOESY NMR
COSY – Correlation SpectroscopY-spin-spin splitting
connectivity within three adjacent covalent bonds.
NOESY – Nuclear Overhouser Effect SpectroscopY- a through space interaction,
that takes place because of the interaction of the magnetic dipoles of two nuclear spins.
(the NMR equivalent of FRET) In practice distances should be up to 5 Å.
הצגה סכמתית של NMR דו מימדי של שני ספינים. הצירים מייצגים רזוננס של שני ספינים שונים. העיגולים על האלכסון מייצגים את הספקטרום החד-מימדי. אם מתבצע מעבר קוהרנטי בזמן הערבוב, מתקבלים רזוננסים מחוץ לאלכסון (ריבועים) .
בדוגמא זו מתרחשת העברה קוהרנטית
בין גרעינים עם רזוננס A ו D ובין B וC .

41. COSY
H2’
H5’, H3’
H6x
H6y
1-NH
3-NH
H6a
H3a
H4’ H4

42. NOESY spectrum of codeine
Or methyl-morphine (an opiate)
Can be extracted from opium or synthesized from morphine
הספקטרום החד- מימדי: 12
13,14 8 7
18OH 9 16
17,18 11 3 5 10 17

43. 13,14
8, 7 12
17,18 9 5 3 18 16 17 10 11

44. 3D conclusions NOESY between H-5 (yellow) and H-18’ (green)

45. Protein folding technology
Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and protein structure determination. An example of the complex pattern obtained from NMR spectroscopy (left), which correlates the nitrogen atoms (15N; vertical axis) of amide groups with the hydrogen atoms (1H; horizontal axis) in a protein. A complex series of measurements that correlate other nuclei (carbon-hydrogen, hydrogen-hydrogen), calculations and deductions allows the structure of the protein to be derived (right).
Pietzsch J., nature,2006