1. 4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai.
Pagrindinės kryptys:
Lignino modifikacija.
Atsparumas virusams, vabzdžiams ir ligoms.
Atsparumas herbicidams.
Žydėjimo ir lytinės brandos modifikacija.
Atsparumas abiotiniam stresui (adaptacija)
Dalis medžiagos paruošta pagal A.Sliesaravičiaus ir V. Stanio leidinį (2005)

2. Vis dažniau įvairiuose informacijos šaltiniuose sutinkami terminai:
“ šiuolaikinė biotechnologija”
“genų inžinerija”
“genetiškai modifikuoti organizmai”
Visa tai nusako viena – naujausius pasiekimus genetikoje (genetikos srityje). Ir šie pasiekimai suteikia galimybes aktyviai dalyvauti paveldimumo proceso pažinime, įsikišti į patį procesą, keisti jį norima kryptimi ir sukurti naujas augalų rūšis, turinčias naujų pageidaujamų savybių, kurių neįmanoma išgauti tradicinės selekcijos būdu.
Maistas yra nuolatinis eksperimentas ir augalų bei gyvūnų selekcija yra vykdoma daug šimtmečių

3. Tradicinės selekcijos efektyvumas didele dalimi priklauso nuo vidurūšinio kintamumo, tačiau yra rūšių (pvz, Pinus resinosa), natūraliai turinčių žemą kintamumo lygį. Dauguma kultūrinių augalų iš viso neturi kai kurių vertingų genų (pvz. genai atsparumui ligoms ir kenkėjams), o tai taip pat riboja selekcijos efektyvumą.
Genetinės inžinerijos uždavinys selekcijoje – padidinti kintamumą.Tam į augalus recipientus įkeliami genai iš kitų organizmų arba dirbtinai susintetinti, pakeisti genai. Poligenų nulemtus požymius yra sunkiau valdyti genų inžinerijos metodais. Pagrindinis augalų transformacijos pranašumas, palyginti su kitais selekcijos metodais yra tai, kad galima įkelti atskirą geną be kitos genomo dalies.
Augalai, sukurti genų inžinerijos metodais, kurie leidžia izoliuoti geną iš bet kurio gyvo organizmo ir įkelti bei integruoti jį į tiriamo augalo genomą, vadinami transgeniniais augalais.
Augalai, gauti somatinės hibridizacijos metodais vadinami transgenominias augalais.

4. Genų inžinerija – rekombinantinių DNR molekulių technologijos – yra pats efektyviausias būdas fundamentinėms genų ir biologijos problemoms spręsti, taikant molekulinės biologijos metodus. Ji leidžia:
- izoliuoti genus iš donoro genomo, kurti genetines bibliotekas;
- klonuoti genus, pažinti jų struktūrą ir funkcijas;
- įkelti geną į recipiento organizmą taip, kad jis aktyviai veiktų ir būtų perduodamas kitoms kartoms.
Genų inžinerija gali būti naudojama pažinimo ir praktiniais tikslais. Pažinimo tikslus realizuojame manipuliuodami su genetine medžiaga ir stebėdami šių manipuliacijų įtaką genų pasireiškimui. Praktiniai tikslai pasiekiami, kai sukaupta informacija leidžia suteikti organizmams norimus požymius.
Prielaidos atsirasti genų inžinerijai susidarė nustačius DNR genetinį vaidmenį ir DNR molekulės struktūrą (Awery et al., 1944, Watson, Crick, 1953). Vėliau ( ) buvo iššifruotas genetinis kodas, nustatyta prokariotų genų veiklą reguliuojančių elementų sudėtis. XX a. septintojo dešimtmečio pradžioje biochemikai atrado restrikcijos-modifikacijos reiškinį, enzimologai genų inžinerijai pateikė platų instrumentų-fermentų rinkinį įvairioms manipuliacijoms su DNR, mikroorganizmų genetikai nurodė metodus, kaip sukonstruotas in vitro DNR molekules įkelti į recipiento ląsteles m. P.Berg laboratorijoje gauta pirmoji rekombinantinė DNR sujungiant DNR fragmentus. Ši data laikoma genetinės inžinerijos gimimo data.

5. Skiriama genų ir genominė inžinerija:
Genų inžinerija sprendžia fundamentinius ir praktinius vieno arba kelių svetimų genų įvedimo, naujų genų reguliavimo ryšių sukūrimo, molekulinės genomo struktūros, genų veiklos reguliavimo, jų reiškimosi problemas ir kt. Šiuo atveju recipiento rūšinė priklausomybė nesikeičia, tik pasireiškia nebūdingi požymiai.
Genomo inžinerijos atveju daug smarkiau kišamasi į genomą, kas gali sukelti naujų rūšių atsiradimą.
Genetiškai modifikuotas organizmas (GMO) – organizmas, išskyrus žmogų, kurio genetinė medžiaga yra taip pakeista ir įgijusi tokių savybių, kurių negalėtų atsirasti organizmui dauginantis natūraliu būdu.

6. Genų perkėlimo metodai
Genų inžinerija
Turinys
Etapai
Priemonės
Genų perkėlimo metodai
Oragnizmų su naujais, nebūdingais rūšiai požymiais konstravimas
In vivo: genų išskyri-mas, jų perkėlimas į naują genetinę aplinką
Virusai, plazmidės, transpozonai
Transdukcija, konjugacija, trans-pozicija, protoplastų suliejimas
In vitro: genų sintezė arba išskyrimas, jų modifikavimas, įjungimas į vektorius, įkėlimas į ląstelę, klonavimas
Restrikcijos-endo- nukleazės, DNR- ligazės, atvirkštinė transkriptazė ir kitos polimerazės, vektoriai ir kt.
Transformacija, mikroinjekcija, elektroporacija ir kt.
Genomo inžinerija
Objektas
Konstravimo metodai
Naujų rūšių individų kūrimas
Virusai
Rekombinacija in vivo ir in vitro
Prokariotų ląstelės
Tarprūšinė konjugacija ir protoplastų suliejimas
Eukariotų ląstelės
Protoplastų suliejimas, izoliuotų branduolių, chromosomų įkėlimas, chromosomų mikroinjekcija į branduolius, izoliuotų mitochondrijų ir chloroplastų perkėlimas

7. Genų šaltiniai Genai Produktas Rezultatas
Augalų virusai
Antiprasminė RNR, inhibitoriai, imuniškumo genai, diagnozavimo priemonės
Diagnostikai, bevirusinė sodinamoji medžiaga, atsparumas virusams
Vabzdžiams kenks-mingi organizmai
Δ-toksinas
Entomopatogenai, toksinai
Biologiniai pesticidai
Fotosintezuojantys prokariotai
Genas
Rubisco
Fotosintezės efektyvumo padidinimas
Agrobacterium tumefaciens antagonistai
pSA tipo
plazmidė
Fitohormonų sintezės slopinimas
Išaugų susidarymo slopinimas
Herbicidams atsparūs mikroorganizmai
Atsparumo herbicidams
Herbicidų skaldymas
Kultūrinių augalų atsparumas
Herbicidams atsparūs augalai
Nepatekimas į ląstelę

8. Genų šaltiniai Genai Produktas Rezultatas
Gyvūnai
Interferonas
Egzogeninis ir endogeninis interferonas
Augalų imunitetas
Antiprasminis prieš RNR virusus
Antiprasminė RNR
Imunitetas virusams
Augalai
Atsarginiai baltymai
Atsarginiai baltymai su pakeista amino rūgščių sudėtimi
Padidinta maistinė ir pašarinė vertė, sintetina kitos rūšys
Gumbelių susidarymą koduojantys genai
Produktai, stimuliuojantys gumbelių susidarymą
Pakeista azoto įsavinimo sistema
Rubisco
Augalai su susilpnintu fotokvėpavimu
Fotosintezės efektyvumo padidinimas

9. Produktyvumo padidinimas
Šis požymis yra kiekybinis. Jį lemia daugelio genų adityvinė veikla. Todėl pasirinkta strategija modifikuoti reguliuojančius genus, įkeliant hemoglobino genus iš gramneigiamos Vitreoscilla bakterijos. Tai padeda geriau aprūpinti augalo fiziologinius procesus deguonimi.
Atsparumas herbicidams
Augalų tolerancija herbicidams buvo pirmoji transgeninė savybė, kuri buvo komercializuota. Ši savybė labai plačiai naudojama agrokultūroje. Tolerancijos herbicidams genai įkeliami į įvairiausius augalus. Tai labai palengvina pasėlių priežiūrą. Klonuoti ir įkelti į aukštesniuosius augalus atsparumo glifosatui (Roundap), fosfinotricinui (BASTA), dalaponui genai, naudojama genetinė transformacija gliufosinatui, triazinui.
ROUNDUP’ui atsparios GM sojos pupelės (dešinėje)
Herbicidams atsparios GM pušys (kairėje)

10. Atsparumas grybinėms ligoms
Atsparumas virusams
Virusinių ligų pažeisti augalai yra lengviau infekuojami kitų patogenų, patys kaupia virusus ir yra užkrato šaltinis. Virusinę infekciją galima slopinti įkeliant į augalo genomą genus, koduojančius specifinius antikūnius ir atpažįstančius virusinius baltymus. Infekcijos atveju tarp susintetintos RNR ir virusinės RNR susidaro dupleksai. Šie suardomi specialia RNA-ze ir liga sustabdoma.
Atsparumas grybinėms ligoms
Augalai pasižymi daugiakomponente atsako į grybinę infekciją sistema, kuri tinkamu laiku ir tinkamoje vietoje bei pakankamu intensyvumu aktyvinta gali apsaugoti nuo grybų patekimo. Įkėlus aktyvų chitinazės geną, dažnai sustiprėja augalų atsparumas grybinėms ligoms.

11. Atsparumas vabzdžiams
Pagrindinai baltymai, lemiantys atsparumą kenkėjams, yra proteazių inhibitoriai, ir Bacillus thuringiensis endotoksinai, taip pat α-amilazių inhibitoriai, lektinai ir neuropeptidai.
Iš Bacillus thuringiensis išskirtas genas, koduojantis toksišką vabzdžiams ir nepavojin-gą žinduoliams baltymą. Šis baltymas sukelia vabzdžių skrandžio ir žarnyno epitelio irimą ir labai selektyviai veikia įvairias vabzdžių rūšis. Proteazių inhibitoriai yra baltymai arba polipeptidai, kurie prisijungia prie proteolitinių fermentų aktyviųjų centrų ir slopina jų katalitinį aktyvumą (slopinamas vabzdžio lervos augimas ir jų daugiau žūva).
Šiuo metu tiriamos atsparios vabzdžiams bulvių, obelų, graikinio riešutmedžio formos (A.Sliesaravičius, V.Stanys, 2005).
GM ekspresuoto pesticidiškumo tuopų lapai (kairėje)
GM kenkėjams toksiški kukurūzai (dešinėje)

12. Atsparumas abiotiniams veiksniams
Abiotiniai veiksniai (sausra, šaltis, mineraliniai toksinai) lemia augalo produktyvumą ir jo raidą. Įkėlus genus, koduojančius fermentą superdismutazę, augalai su didesniu šio fermento kiekiu buvo labiau atsparūs herbicidams, ozonui ir sausrai. Didinant atsparumą šalčiui keičiamas santykis tarp sočiųjų ir nesočiųjų riebiųjų rūgščių, didinamas ląstelės osmosinis slėgis.
Siekiant padidinti atsparumą sunkiesiems metalams, į augalus perkeliamas genas iš gyvūnų, koduojantis baltymo metalotioneino sintezę. Šis baltymas sujungia sunkiuosius metalus.
Vyriško sterilumo indukavimas
Kuriant heterozinius hibridus, labai svarbu kontroliuoti augalų sterilumą. Klonuotas ”genas-žudikas” (barnasė) pasireiškia tik žiedadulkių formavimosi metu, todėl žiedadulkės nesivysto. Norint atkurti augalų fertilumą, buvo klonuotas genas (bastar), kurio produktai sujungia ”geno-žudiko” produktus. Tokiu būdu buvo sukurta vyriško sterilumo linijų gavimo ir jų fertilumo atkūrimo bet kuriai augalų rūšiai sistema.

13. Ateities perspektyvos 2005-2015
Genetinės modifikacijos taikymo žemės ūkyje proceso sudėtinės dalys ir laiko trukmė
Geno identifikacija
Duomenų tikrinimas
Technologijos išvystymas
Technologinis suderinimas
Galutinis pateikimas
24-48 mėn.
12-24 mėn.
12-36 mėn.
Laiko intervalas nuo pradžios iki galutinio rezultato apima 6-13 metų, o miško medžiams tai užtruktų žymiai ilgiau
Ateities perspektyvos
Atsparumas herbicidams, kenkėjams ir patogenams
 Atsparumas sausrai, padidintam druskingumui, sunkiųjų metalų taršai, temperatūrų ekstremumams
 Pagerinimas kultivuojamų žemės ūkio kultūrų maistinės vertės ir laikymo trukmės
 Pagerinimas kultivuojamų kultūrų aromatinių savybių
 Alergenų pašalinimas
 Farmaceutinių medicinai naudojamų augalų savybių didinimas
Vasil I.K. 2003

14. GMO nauda
1. Ekonominė
2. Socialinė ir ekologinė.Mažėjant pesticidais apdirbamų ir intensyvai ariamų laukų plotams mažiau nadojama žemės ūkio technika, o tuo pačiu mažėja išlaidos degalams ir anglies dvideginio išmetimas į atmosferą. Mažiau teršiams herbicidais gruntas ir vanduo. Nenaudojant laukuose insekticidų padidėja naudingų vabzdžių.
2/3 maisto produktų JAV supermarketuose turi sudėtyje genetiškai modifikuotų augalų

15. Medžiai taip pat sulaukia vis didėjančio dėmesio genetinės inžinerijos srityje!
Tuopos ir drebulės - Populus
Mediena (pjautiniams gaminiams, popieriui)
Panaudojama kaip modelinė rūšis kitų rūšių tyrimuose
Oregono valstija – 7 metų amžiaus tuopų plantacija

16. Miško medžių rūšių transgeninė domestikacija
• Modifikuojama mediena – popieriaus masei, pjautiniams sortimentams, energijai
• Modifikuojama lajos struktūra
• Žydėjimo kontroliavimas
sterilumas: padidintas produktyvumas, genų pasiskleidimo išvengimas, alerginių medžiagų sumažinimas (žiedadulkės ar vaisiai)
indukcija: trumpesnis selekcijos ciklas, naujos selekcijos galimybės
• Atnaujinimas – kloninis dauginimas
• Kenkėjų kontroliavimas – atsparumas vabzdžiams, ligoms ir herbicidams
• Kiti požymiai – vaistinių savybių pagerinimas
EST ar genomo sekos
Mikrogardelių ekspresijos studijos
Kandidatinių genų identifikavimas
Funkcinė analizė panaudojant
transgeninius medžius (galimai)
Fenotipinė analizė panaudojant
lauko ar šiltnamio bandymus
Genetinio atsako tikslinimas
Selekcionuoti varietetai, selekcija genų pagrindu (GAS)

17. Genetiškai modifikuotų augalų keliami pavojai ir jų vertinimas
Genetiškai modifikuoti organizmai:
- patys gali neturėti tiesioginės neigiamos įtakos žmonių sveikatai, bet jų metabolizmo produktų poveikis gali būti toksiškas arba alerginis ir pasireikšti daug vėliau po kontakto su tokiais organizmais;
- gali būti patogeniški žmonėms, kurie turi imunitetą natūraliai egzistuojantiems organizmams;
- gali būti potencialus nepageidaujamų genų kombinacijų perdavimo kitoms organizmų rūšims horizontalaus genų dreifo metu šaltinis;
- gali pasireikšti netikėtų požymių genetiškai modifikuotuose augaluose, neprognozuojamai pakisti augalų populiacijos dėl konkurencinio pranašumo, palyginti su nepakeistais augalais.Tai iš esmės gali pakeisti evoliucijos kryptį ir sukelti nevienodas pasekmes teik gyvūnams, augalams, tiek ir žmonėms.
Genų inžinerija palyginti nauja biotechnologijos sritis ir iki šiol pasaulyje ji vertinama nevienareikšmiškai. Didžiausias pavojus iškyla kai genetiškai modifikuoti augalai ar gyvūnai išleidžiami į aplinką, kur jie turi galimybę kryžmintis su laukiniais augalais ar gyvūnais. Taip gali būti sunaikintas natūralus genofondas, pažeistas ekosistemų stabilumas.

18. Efektyvumas, tikslumas ir atsakomybė
• Tyrimai yra brangūs, ypač genomikoje
– tikslas yra kokybiškos žinios ir socialinė nauda
• Genetinės transformacijos svarba yra lemianti
• Dauguma svarbių miško biologijai požymių yra nepakankamai išreikšti juvenaliniame amžiuje ar užauginti laboratorijoje
– lauko bandymai yra labai reikalingi ir lemiami
• Sterilūs (lytiškai) ar nebrandūs medžiai turėtų būti naudojami tyrimuose
• Transgeninės genų modifikacijos pasižymi tuo, kad yra paveldimos ir laikui bėgant domestikuojasi: stabilizuojanti selekcija
– modifikuojami požymiai pasižymi didele variacija ir yra paveldimi
– reti transgeniniai mutantai lauko bandymuose yra “paskandinami” foninių žiedadulkių

19. Lignino genetinė modifikacija
Lignino sandara
Medienos ląstelės pagrinde sudarytos iš celiuliozės, hemiceliuliozės ir lignino, kuris supaprastintai vadinamas ląstelių klijais.
Kaip ir celiuliozė, ligninas sudarytas iš C, H ir O2, tačiau jie išdėstę skirtingai, suformuodami skirtingas molekules, klasifikuojamas kaip fenolių polimerai, sudaryti iš feno-propano monomerų.
Ligninas pagrinde randasi tarpląstelinėje terpėje ir suklijuoja ląsteles vieną prie kitos. Apytikriai liginas sudaro 1/3 sausos medienos masės ir yra svarbus komponentas celiuliozės gamyboje. Ligino ypač daug kompresinėje medienoje (stiebo sulinkimo pusėje).
Pušies medienos ląstelės (tracheidės) (5 mm ilgio plonos ląstelės)
Ksilemos medienos ląstelės (tracheidės) struktūra. W- tuščias vidus (lumen). ML- tarpląstelinė terpė pripildyta lignino. Ląstelės sienelė: P- pirminė, S1, S2, S3-3 antrinių sienelių sluoksniai. Brūkšneliai ant sienelių parodo mikrofibriles.
Pušies kompresinė mediena (žym. rodyklėmis)
D. Danusevičius

20. Pagrindinės liginio funkcijos ir ekonominis panaudojimas
Biologinės funkcijos
Liginas užpildo tarpląstelinę terpę taip suklijuodamas ląsteles ir priduodamas medienai tvirtumą.
Ruošiantis žiemai, medelių ūgliai lignifikuojasi- virsta iš žalių sultingų į sumedėjusius rudus- tarpląstelinėje terpėje sparčiai sintetinamas ligninas virsta į želė formos masę ir apsaugo medienos ląsteles nuo šalčio).
Ligninas padeda formuoti vandens indus, ligniną sunku suskaldyti todėl jis yra efektyvus fizinis barjeras ento ir fito kenkėjams (užsikrėtus grybine liga padidėja lignino sintezė).
Ekonominis panaudojimas:
Daugiau lignino: tvirtesnė mediena, didesnė energetinė vertė (ligninas išskiria daugiau energijos nei celiuliozė),
Mažiau lignino: popieriaus gamyboje, kur celiuliozė atskiriama nuo lignino, kas yra ekonomiškai ir ekologiškai brangus procesas. Todėl mažesnis ligino kiekis pageidaujamas požymis popieriaus masės gamyboje, kai reikia atskirti ligniną nuo celiuliozės.
Picea abies sėjinukų stiebelių lignifikacja A- lignifikuota, B nelignifikuota dlays.
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai

21. Lignino kiekio sumažinimas naudojant Antisens geno įterpimą
Sens ir antisens DNR paaškinimas
Dabartiniu metu yra nustatyta dauguma su liginio sinteze susijusių enzimų ir jos koduojančių genų. Dešinėje parodytas lignino polimerizacijos iš monolignolių schema, kur dalyvauja du enzimai Oksidazė ir peroksidazė.
Sens grandinė koduojanti geną
DNR
RNR
RNR
Jai atvirkščia DNR seka vad. antisens
DNR
Galima dirbtinai įterpti naują geną, produkuojantį iRNR, kuri yra komplimentari (tinkanti jungčiai) su liginio geno iRNR. Tokiu būdu bus sumažintas lignino kiekis medienoje.
Pinus medienos ląstelės 1 2
Lignino genas 3
DNR
DNR
RNR
Lignino geno iRNR
Dviejų grandinių iRNR
DNR
Naujo geno iRNR
DNR
Naujas genas
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai

22. Tyrimų pavyzdys: lignino modifikacija Populus
Identifikuotas vienas iš lignino sintezėje dalyvaujančių genų 4CL ir sumažinta jo ekspresija, naudojant antisens metodą.
Pakeitus lignino sudedamų dalių syringilio ir guaiacylio santykį, galima lengviau atskirti ligniną nuo celiuliozės (Pinus radiata Jounin ir Goujon 2004).
Identifikuotas vienas iš syringilio sintezėje dalyvaujančių genų- CAld5H (reguliuojančio syringilio sintezės intensyvumą) ir modifikavo CAld5H ir 4CL genų ekspresiją drebulėje. Rezultate GMM turėjo 52 proc. mažiau lignino, taip pat GMM buvo pagreitinta ksilemos ląstelių branda (Populus Chiang ir kt. (2003).
Transgeninės drebulės su padidinta CAld5H geno ekspresija ląstelės parodė didesnį jų senelių storėjimo greitį (matoma reporterinio geno ekspresija).
Ref.: "Combinatorial modification of multiple lignin traits in trees through multigene cotransformation" by Laigeng Li, Yihua Zhou, Xiaofei Cheng, Jiayan Sun, Jane M. Marita, John Ralph, and Vincent L. Chiang. PNAS NEWS
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai

23. Atsparumas oksidaciniam stresui
Tokie aplinkos stresai kaip ozonas, intensyvi šviesa, karšis ir sausra gali sukelti oksidacinį stresą augalo ląstelėse.
Oksidacinis stresas (OS) apibrėžiamas kaip žalingų laisvųjų radikalų molekulių kaupimasis augalo ląstelėse. Laisvieji radikalai tai atomai ar jų grupės turintys neporinį elektronų skaičių (laisvą elektroną) ir todėl yra labai reaktyvūs, gali pažeisti ląstelių sienelės, baltymų ir DNR molekules. Molekuliniame lygmenyje OS sukeliamas kai laisvieji radikalai prisijungia iš kitos molekulės deguonies atomo vieną elektroną. Šioje formoje deguonis sudaro ypač reaktyvius hidrokslio radikalus.
Enzimas superoksidismutazė (SOD) skaldo laisvuosius radikalus ir taip juos neutralizuoja. Genetinė modifikacija, šiuo atveju, galima įterpti modifikuotą SOD geną su dažniau transkribuojamu promotoriumi ar įterpiant daugiau SOD geno kopijų.
Bandymai parodė, kad tabako augalai su padidinta SOD geno ekspresija buvo labiau atsparūs ozono poveikiui, o GM medvinės , alfaalfa ir kukurūzų augalai buvo atsparesni aplinkos stresams (Breusegem ir Inze 2004).
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai

24. Atsparumas oksidaciniam stresui
Su sumedėjusiais augalais tyrimai atliekami Suomijos biotechnologijos institute, kur Betula pendula medeliai paveikiami kritinėmis ozono dozėmis, kas sukelia laisvų radikalų formavimąsi ląstelių sienelėse bei kartu aktyvuoja už šių radikalų neutralizaciją atsakingus genus.
Iš kontrolinių ir paveiktų medelių tų pačių audinių identifikuojami tie genai, kurie buvo išreikšti stresą patyrusiuose augaluose bet nebuvo išreikšti kontroliniuos augaluose (2 to pačio genotipo kopijos gali būti naudojamos kaip kontrolė ir kaip testuojamas augalas, taip eliminuojant skirtingų genotipų efektą)
Šie kandidatiniai genai toliau tiriami: sekvenuojami, skaidomi į funkcines dalis, lyginami su genais duomenų bazėse bei naudojami GM išbandymuose. Indukuojamos dirbtinės mutacijos ir stebima kuris iš kandidatinių genų turi stipresnę įtaką požymio išraiškai.
Kadangi O3 poveikis aktyvuota etileno sintezės genų veiklą, bandoma etileno kaip signalinės molekulės apie stresą perdavėjo vaidmuo atsakant į laisvų radikalų atsiradimą ir atitinkamų gynybinių genų aktyvaciją (Arabidobsis).
Pagrinde tyrimai su tabaku ir arabidobsis (Breusegem ir Inze 2004).
Laisvų radikalų formavimasis betula pendula ląstelių sienelėse paveikus ozonu.
Išreikštų genų identifikacijos modelis
DNR
RNR
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai

25. Atsparumas virusams
Po bakterijų ir grybinių ligų virusai yra trečia pavojingiausia augalams patogenų (mikroorganizmų sukeliančių pakenkimus) kategorija. Virusai įsiterpia į apkrėstos ląstelės DNR ir dideliais kiekiais gamina savo apvalkinio baltymo ir DNR ar RNR kopijas ir taip sutrikdo normalų ląstelės funkcionavimą ar indikuoja užprogramuotą ląstelių žuvimą, kad išvengti kaimynių audinių infekcijos.
Genetinė modifikacija gali padėti (Jeske 2004):
Kosupresija, kai identifikuojamas viruso baltyminio apvalkalo sintezės genas ir jis įterpiamas į augalo DNR, virusinės infekcijos atveju, augalo imuninė sistema greičiau sureaguoja į padidintą šio geno išraišką ir blokuoja tiek virusinio tiek modifikuoto geno transkripciją (paprastai metilinant geno promotorių).
Antisens metodai, kai įterpiami virusinių genų antisens genai blokuojantys jų transliaciją ar dviejų grandinių RNR molekulės atpažįstamos specifinių RNR degradazės enzimų ir yra degraduojamos.
Daugumai žemės ūkio kultūroms pavojingų virusų genai identifikuoti ir jų sekos žinomos (Jeske 2004).
Virusinio pobūdžio lapų pakenkimai
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai

26. Atsparumas vabzdžiams
Tai labiausia paplitęs GM požymis tiek žemės tiek miškų ūkyje.
Principas: identifikuojamas ir įterpimas atitinkamam kenkėjui nuodingo baltymo sintezę sąlygojantis genas. Taip išvengiama ekonominių nuostolių bei brangaus ir gamtai žalingo purškimo insekticidais.
Baltymas gali būti nuodingas ir giminingam kenkėjui. Taip GM patirtis iš žemės ūkio buvo pritaikyti miško medžiuose.
Genetiškai modifikuota drebulė Kinijoje: įterpus modfiikuotą BtCRY geną Populus tomentosa tapo atspari lapų graužikams
Sėkmingiausias pavyzdys CRY genai, identifikuoti žemės bakterijoje Bacillus thuringiensis (Bt CRY genai) sąlygojantys kenkėjams nuodingų baltymų sintezę. CRY geną įterpus į augalus jie tampa atsparūs kenkėjams. Naudojami ir virškinimo toksinių genai (PIN2 bulvės genas, stabdantis proteazės sintezę). Bandymai atlikti su drebule, maumedžiu, eukaliptu, kai kuriomis pušies ir eglės rūšimis) (Klopfenstein ir kt. 1991, Heuchelin ir kt. 1997, Sullivan ir Lagrimini 1993, Lida ir kt. 2004).
Iki 2006 m. vienintelė komerciniu būdu naudojama GM miško medžių rūšis yra Populus tomentosa Kinijoje: įterptas vienam iš lapų kenkėjų nuodingą baltymą sintetinantis modifikuotas CRY genas.
Jautrios vabzdžių gentys: Lepidoptera, Coleoptera, Dipytera.

27. Atsparumas grybinėms ligoms
Enzimai glutanazė ir chitinazė yra susiję su patogeninės grybienos ląstelių sienelių hidrolizacija ir padidina augalo atsparumą grybinei ligai (pvz. Cercospora bacco tabako augaluose) (Tenhaken 2004).
Antimikrobiniai peptidų (defencinų) genai ženkliai padidina atsparumą prieš bakterijas, grybines ligas ir net virusus. Pvz. teigiamų rezultatų davė bandymai su transgeniniais tabako augalais su iš ridiko izoliuotu defensino genu RsAFLP2: ženklai padidėjo atsparumas grybinėms infekcijoms. Didesnė lipidų transportavimo peptidų LTP2 genų ekspresija transgeniniuose Arabidobsis augaluose padidino atsparumą grybinei infekcijai (Tenhaken 2004).
Modifikuoti ribosomas deaktyvuojančių baltymų (RIP) genai su pažeidimu indukuojamu promotoriumi deakatyvuoja tik svetimų ląstelių ribosomas (sustabdo baltymų sintezę), ir padidina atsparumą prieš mikrobus ir grybines ligas (bandymai su tabako augalais) (Tenhaken 2004).
Programuotos ląstelių mirties geno ekspresija prie šio geno prijungiant patogeno indukuojamą promotorių. Kartu su žuvusiomis ląstelėms žūna ir patogenas (Tenhaken 2004).
Gryninės ligos pakenkti Pinus medelio spygliai.
Programuota ląstelių žūtis (šviesūs taškai).
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai

28. Atsparumas herbicidams
Įgijus atsparumą herbicidams, galima efektyviai kontroliuoti agresyvias piktžoles ir nepageidaujamas krūmų rūšis miško želdiniuose.
Principas:
identifikuojamas ir įterpimas modifikuotas genas, sintetinantis tam tikrai herbicidų klasei jautrius bet modifikuotus baltymus ir herbicido toksinai nesijungia prie modifikuoto geno baltymų (pvz. herbicidas glifosatas (Roundap) blokuoja baltymų triptofano, tyrosino ir fenilanino sitenzę Populus alba, Populus trichocarpa, Eucalyptus grandis, Larix decidua ir Pinus radiata medeliuose, herbicidas chlorosurfulonas blokuoja baltymų valino ir leucino sitenzę Populus tremula ir Pinus radiata).
b) identifikuojamas ir įterpimas iš mikrobų izoliuotas genas koduojantis enzimą, kuris detoksikuoja (sugeria ir degraduoja) herbicido toksinus (GM naudota įvairių Populus rūšių medeliuose, Eucalyptus, Picea abies (Ho ir kt. 1998, Bishop-Hyrley ir kt. 2001).
GM Pinus radiata atsparūs herbicidų poveikiui (dešinėje)
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai

29. Atsparumas sunkiesiems metalams
Sunkieji metalai (pvz. Cu, Zn, Ni, Cd, Hg) sudaro junginius su azoto atomais baltymuose ir taip juos deaktyvuoja, bei junginių su 02 pasekoje produkuoja žalingus laisvuosius deguonies radikalus. Šie pakenkimai dažnai sukelia spyglių ar lapų chlorozę (geltimas dėl chlorofilo netekimas) ir stabdo augimą.
Principas: randami su atsparumu susiję genai ir stiprinamas jų poveikis modifikuojant šiuos genus prijungiant dažniau transkribuojamus promotorius.
Identifikuotos genų grupės:
Neutralizavimas per junginius su nemetalais (paprastai jungtys su baltymais vad. paprasfitochelatinu, metalotioneinu))
Sekvestracija (metalo jono prisijungimas).
Šalinimas iš ląstelių.
Biotransformacija (genų modifikacija iš bakterijų atsparių tam tikram metalui (pvz. merA genas iš bakterijos, skaidantis gyvsidabrio jonus).
Taisymas- genai atsakingi už pakenktų audinių gijimą.
Pinus ir Picea medžių spygliai pakenkti sunkiųjų metalų taršos.
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai

30. Žydėjimo ir vyriško sterilumo indukcija
Medžiai be vyriškų žiedų/strobilų neskleistų žiedadulkių: (a) GM medžiai gali būti bandomo be GM pasklidimo rizikos, (b) medžiai sodinami miestuose, kur yra nemažai žiedadulkėms alergiškų žmonių.
Principas:
(a) įterpimas ląsteles žudančių genus (pvz. Barnazės genas, degraduojantis visas RNR) su žiedinių struktūrų genų promotoriais (bandymai su Populus. Kitas bakterijos rastas genas Barstar yra Barnazės inhibitorius ir naudojamas kontroliuoti jo ekspresiją
(b) su žiedinių struktūrų iniciacija susijusių genų supresija ar, norint saktinit žydėjimą, žydų formavimuisi kliudančiūų genų (FLC ar EMF) supersija antisens metodu.
Pinus radiata, Arabidobsis, Betula pendula, Ecalyptus, Populus rūšyse identifikuoti žiedų iniciacijoje dalyvaujantys ir vyriškų strobilų formavimo genai ir jų promotoriai (pvz. LEAFY, PrCHS1 ir PrCHS2 ekspresijos tyrimai ir cDNR sekos, Walden ir kt. 1999).
Ankstyvo žydėjimo įjungimas: padidinta LEAFY geno ekspresija su CaMV35S promotoriumi indukavo ankstyvą Arabidopsis žydėjimą.
Bandomos rūšys: Eucalyptus, Populus, Betula. Skinner ir kt. 2000, Mellan ir kt 2001, Lemmetyinen ir Sopanen 2004.
Punus sylvestris vyriški strobilai.
LEAFY Geno atsakingo už strobilų formavimą ekspresija drebulės pumpure (šviečiantis markerinis genas uidA.
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai

31. Atsparumas aplinkos stresams (1)
Atsparumo tokiems stresams kaip sausra ar šaltis požymiai yra kompleksinės daugelio genų sinergetinės veiklos pasekmės. Todėl, norint pasiekti rezultatų, reikia skaidyti šiuos kompleksinius požymius.
Išskiriamos tokios atsako į stresą kategorijos: (a) greita reakcija (šalinami tiesioginiai pakenkimo padariniai; atsako sistemos panašios tarp rūšių), (b) pokyčiai, kad pasiekti naują metabolizmo pusiausvirą, esant stresui (pvz. uždaryti stomatas esant dehidracijai), (3) ilgalaikiai vystymosi pokyčiai.
Pavasarinių šalnų pakenkti Picea abies genotipai bandomuosiuose želdiniuose.
Atsako į stresą strategijos: dehidracija, šaltis, karštis, druskingumas streso- pajautimas ir signalo perdavimas (Oksman-Caldentey ir Bardz 2004.)
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai

32. Atsparumas aplinkos stresams (2)
Miško medžių modifikacijos ir tyrimų kryptys:
Skatinti metabolizmą, įterpiant aktyviau transkribuojamas atsakingų genų kopijas ar kelias geno kopijas (pvz. spartesnis augimas per azoto asimiliacijos efektyvumo padidiną (tyrimai su Picea ir Populus, Gallardo ir kt. 1999) ar osmotinio slėgio reguliavimas ksilemos tracheidėse.
Streso signalo perdavimo sistemos efektyvumo didinimas (pvz. atsakas į dehidraciją ir vaksinių junginių sintezė lapo epidermyje, ar stomatų uždarymo greitis ir standumas; stiebo ir spyglių lignifikacijos greitis atsake į žemesnes temperatūras, atsako į fotoperiodo pokyčius greitis; pagrinde su signalinių molekulių (giberelinas, ABA rūgštis, etilenas, citokininai ir kt.) sinteze susiję genai.
Ekspresijos tyrimai ir skirtingai ekspresuotų DNR analizė bei susijusių genų identifikacija (atsako į stresą tyrimai klimatinėse kamerose, cDNR analizės ir EST žymenų kūrimas).
Genų ekspresijos tyrimų principas: pušies pumpuro (a) ir vegetatyviniai (b) audiniai a) b)
Išreikšta
iRNA
cDNA
DNR
microgardelės: hibridizacija su žinomų genų dalimis
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai

33. GM tyrimai su miško medžiais
Su genetine modifikacija susijusių tyrimų pasiskirstymas pagal miško medžių gentis (FAO 2004).
Su genetine modifikacija susijusių tyrimų pasiskirstymas pagal genetinės modifikacijos tikslus (FAO 2004).
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai