1. Ústav lekárskej biológie, LF UPJŠ v Košiciach
CYTOGENETIKA
CHROMOZÓMY
KARYOTYP

2. Takmer celý obsah DNA eukaryotickej bunky sa nachádza v jadre, kde spolu s bielkovinami vytvára štruktúry – chromozómy – viditeľne v deliacej fáze – mitóze.
V nedeliacom sa jadre sa chromozómy javia ako granulárna masa – CHROMATÍN (chromozómy sú hydratované, dekondenzované a rozvinuté)

3. Heterochromatín a euchromatín
predstavuje časti chromozómov obsahujúce málo alebo žiadne gény,ako napr.
centroméry a teloméry
je kondenzovaný
môže obsahovať transpozóny a "junk" DNA;
je replikovaný v neskorej S-fáze b. cyklu;
crossing over v meióze je zriedkavý
gény lokalizované v heterochromatíne sú vo všeobecnosti inaktívne, t.j. nie sú transkribované
Euchromatín
predstavuje časti chromozómov obsahujúce množstvo génov
Je kondenzovaný do voľných slučiek 30-nm vláken.
Je oddelený od priľahlých oblastí heterochromatínu inzulátormi.
Slučky heterochromatínu sú zväčša lokalizované v blízkosti komplexov jadrových pórov.

5. a) c) b) d)

8. DNA
Nukleozómové
vlákno (11 nm)
Chromatínové
vlákno (30 nm)
Chromatínové slučky
(300 nm)
Heterochromatín
(700 nm)
Chromozóm

9. Pomer NK a bielkovín je 60% ku 40%
Eukaryotické chromozómy
- genetické jednotky bunky zložené z DNA a bielkovín
Chemické zloženie chromozómov
DNA: jedna lineárna dvojvláknová molekula (napr. ľudský chromozóm č.1 – 2,5x108bp – cca. 15cm, najmenší chromozóm č.21 – 0,5x108bp – cca. 3 cm)
RNA: molekuly rRNA, tRNA a mRNA transkribované z DNA
Bielkoviny: významná zložka chromozómov euk. buniek. Podľa charakteru delíme na:
históny – bázické bielkoviny (Lys, Arg, His)
nehistónové bielkoviny
Pomer NK a bielkovín je 60% ku 40%

10. Históny Malé molekuly bázických bielkovín (100-200 AMK).
Bola zistená evolučná stálosť sekvencií AMK v reťazci histónov, takmer 100% zhoda (rast., živoč., človek).
Históny sú syntetizované v plazme.
Typy histónov: H1, H2A, H2B, H3, H4
Jednotlivé históny sa líšia svojou štruktúrou a chem. zložením.
V spermiách cicavcov sú históny viac bázické.
Funkcia histónov:
- priestorové usporiadanie DNA do nadmolekulovej štruktúry pri tvorbe chromozómu. Regulácia transkripcie.
Nehistónové bielkoviny: kyslý charakter, viac ako 100 druhov bielkovín – enzýmy – replikácia – transkripcia – génové regulácie

11. Históny majú pozitívny elektrický náboj, preto môžu vytvárať iónové väzby s negatívne nabitými fosfátovými skupinami v DNA
Chromatínové vlákno je usporiadané do veľkého počtu slučiek, ktoré vyčnievajú z centrálneho skeletu tvoreného nehistónovými chrom. proteínmi
Pri kondenzácii dochádza ku kontrakcii NHC (non-histone chrom. proteins)

12. Submikroskopická štruktúra chromozómu
zložitá nadmolekulárna organizácia DNA a histónových bielkovín
celková dĺžka DNA v ľudskej diploidnej bunke (1,5 – 2 m) – 3x109 bp, veľkosť jadra (5-10 mikrónov)
základná submikroskopická jednotka chromozómu je nukleozóm

14. Nukleozóm: sa skladá z jadra a DNA (200bp)
Nukleozómové jadro: oktamér 2xH2A, H2B, H3 a H4 (kladne nabitý).
DNA vytvára 2 otáčky okolo nukleozómu. H1 slúži ako viazač DNA medzi dvoma nukleozómami.
Nukleozómové vlákno

15. Mikroskopická štruktúra chromozómu
Chromozómy svetelným mikroskopom môžeme pozorovať a hodnotiť v metafáze bunkového delenia.
Morfológia chromozómov sa hodnotí podľa umiestnenia centroméry, kt. spája dve dcérske chromatidy a rozdeľuje chromozóm na p a q rameno.
Medzi morfologické charakteristiky patrí aj veľkosť chromozómu a morfologická štruktúra.
p-ramienko
q-ramienko
teloméra

16. Počet chromozómov
Pre každý biologický druh je charakteristický počet chromozómov (diploidný počet (2n) – telové bunky, haploidný počet (n) - gaméty)
Príklady počtu chromozómov u rôznych druhov:
Druh Diploidný počet (2n)
Plazmódium malárie 2
Drozofila melanogaster 8
Rak
Kapor
Pes
Hov. Dobytok 60
Kôň
Myš
Šimpanz, orangutan, gorila 48
Človek

17. Teloméry - Telomeráza
Teloméry: koncové časti chromozómov so špeciálnou sekvenciou dusíkatých báz, kt. ohraničujú koncové časti pred zlomami, kt. uľahčujú fúziu chromozómov a prestavby chromozómov – chromozómové mutácie
Telomeráza: enzým, nukleoproteín – okrem proteínovej zložky má zabudovanú v molekule aj sekvenciu ribonukleotidov – CCCAAU (človek).
Význam telomerázy je v kompletizácii zaostávajúceho vlákna DNA v dôsledku zostrihu primerov RNA, kt. zahajujú replikáciu DNA v Okazakiho fragmentoch.

19. Každý biologický druh má svoj charakteristický karyotyp – genetická charakteristika.
metacentrický
submetacentrický
akrocentrický
telocentrický

20. Chromozómy v diploidnej bunke sa vyskytujú v pároch
Chromozómy v diploidnej bunke sa vyskytujú v pároch. Pár chromozómov zhodných v tvare a štruktúre sa označuje ako homologický pár.

21. Podľa určenia pohlavia chromozómy delíme:
telové, somatické, autozómy
pohlavné, gonozómy, sex-chromozómy, heterochromozómy
Podľa intenzity farbenia chromozómu rozoznávame:
heterochromatínové časti (centroméry, teloméry), geneticky neaktívne časti, kt. sa replikujú v neskorej S-fáze – výraznejšie farbiteľné časti
euchromatínové časti – menej výrazne farbiteľné časti, genetický aktívne, dokonale dekondenzované a odvinuté

24. Klasifikácia chromozómov u človeka – Denverská (1961), Parížska (1972)
Ku správnemu určeniu počtu chromozómov prispela modifikácia metódy, aplikácia fytohemaglutinínu (PHA) – stimulácia delenia leu, hlavne aplikácia kolchicínu – zastavenie mitózy v metafáze a použitie hypotonického roztoku, kt. spôsobil disperziu chromozómov v priestore.
Klasifikácia chromozómov u človeka – Denverská (1961), Parížska (1972)
počet
Skupina Charakteristika Autozómy Gonozómy Muž Žena
A najväčšie metacentrické
B veľké submetacentrické
C stredne veľké submetacentrické X
D väčšie akrocentrické
E malé metacentrické
F najmenšie metacentrické
G najmenšie akrocentrické Y

25. Súbor chromozómov diploidnej bunky s charakteristickým tvarom a počtom chromozómov sa volá KARYOTYP.

26. Presný počet chromozómov v diploidnej bunke u človeka stanovili Tjio a Levan v roku 1956, keď dokázali, že človek má 46 chromozómov. Do uvedeného obdobia sa za pravdivý považoval fakt, že ľudské bunky majú 48 chromozómov.

27. Štruktúra ľudských chromozómov
DNA eukar. bunky je rozdelená do jednotlivých chromozómov, kt. predstavujú samostatné molekuly DNA.

36. Poznanie štruktúry chromozómov prispelo k rozvoju nového odvetvia genetiky – CYTOGENETIKY, čo našlo uplatnenie aj klinickej genetike. Potvrdzuje to aj fakt, že už v 60. rokoch bol cytogenetický diagnostikovaný Downov sy., Edwardsov sy., Patauov sy. a iné
Uplatnenie cytogenetickej analýzy:
diagnostická metóda – určenie syndrómov
diagnostika VVCH
diagnostika nádorov (leukémia)
prenatálna diagnostika (bunky plodu)
-hodnotenie buniek za spontánnych potratov a iných reprod. problémov
-hodnotenie chromozómov u rizikových profesií (mutagény)
-in vitro experimenty na mutagenézu nových chemikálií, liekov, prísad do potravín

40. Diabetes mellitus and deafness (DAD)
this combination at an early age can be due to mitochondrial disease
Diabetes mellitus and deafness can be found together for other reasons as well
Leber hereditary optic neuropathy (LHON)
visual loss beginning in young adulthood
Wolff-Parkinson-White syndrome
multiple sclerosis-type disease
Leigh syndrome, subacute sclerosing encephalopathy
after normal development the disease usually begins late in the first year of life, but the onset may occur in adulthood
a rapid decline in function occurs and is marked by seizures, altered states of consciousness, dementia, ventilatory failure
Neuropathy, ataxia, retinitis pigmentosa, and ptosis (NARP)
progressive symptoms as described in the acronym
dementia
Myoneurogenic gastrointestinal encephalopathy (MNGIE)
gastrointestinal pseudo-obstruction
neuropathy

42. DELENIE BUNIEK

43. Delenie buniek základná charakteristika života
vznik nových buniek delením existujúcich
Význam delenia buniek:
U jednobunkových organizmov delenie – rozmnožovanie
U mnohobunkových organizmov – delenie zygoty a následné bunkové delenia – embryonálny vývoj, delenia v postembyonálnom vývoji – rast organizmu
Náhrada strát buniek v dôsledku fyziologického opotrebovania (erytrocyty, bunky epidermis 1010/deň), patologických procesov a mechanického poškodenia buniek

44. Typy bunkového delenia
priame delenie – amitóza
nepriame delenie – mitóza
redukčné delenie - meióza
Priame delenie: - prokaryotické bunky
Replikácia kruhovej DNA je nasledovaná priečnym rozdelením bunky (30-60 min.).
Materská bunka
Dcérske bunky

45. Medzi hlavné fázy bunkového cyklu patria:
Mitotické delenie: -nepriame delenie – prebieha v jednotlivých fázach, kt. reprezentujú bunkový cyklus (cyklické striedanie dejov v období od vzniku dcéskej bunky po jej opätovné rozdelenie).
Medzi hlavné fázy bunkového cyklu patria:
interfáza – 3 štádia : G1 – S – G2
mitotická fáza – 5 štádií : profáza, metafáza, anafáza, telofáza, cytokinéza
cytokinesis

46. G1 štádium:
-postmitotické štádium – od vzniku dcérskej bunky po S – štádium
-35% trvania bunkového cyklu (výrazná variabilita – hodín)
Prejavuje sa tu adaptačná schopnosť na vonkajšie podmienky, zrýchľovanie a spomaľovanie bunk. cyklu.
Ak bunka nepokračuje v bunk. cykle zostáva v G1 štádiu resp. v G0, bunka vykonáva metabolické procesy (proteosyntéza), ale na bunkové delenie sa aktívne nepripravuje.
G0 štádium je charakteristické pre kmeňové, pluripotentné bunky napr.: bunky krvotvorby, epidermis.
- hlavný kontrolný uzol – regulácia bunk. cyklu – rozhoduje o pokračovaní bunky do S-štádia ak sú splnené podmienky: kritický objem, syntéza enzýmov a iných biopolymérov, syntéza RNA a DNA polymeráz

47. S štádium:
-syntetické štádium DNA, naväzuje na G1 v prípade, že boli uskutočnené nutné deje a bunka má priaznivé podmienky pre syntézu DNA.
-trvanie S-štádia konštantné pre daný typ buniek (8-20 hod. = cca.45% bunk. cyklu)
-výsledok: vznik tetraploidnej bunky  vznik dvoch chromatíd (reduplikácia chromozómov)
Okrem replikácie DNA v štádiu prebieha syntéza histónových bielkovín, riadená asi 40 génmi (syntéza mtDNA je nezávislá na syntéze jadrovej DNA).

48. G2 štádium:
-postsyntetické, relatívne krátke trvanie (10% bunk. cyklu)
-pokračuje syntéza bielkovín
-rast bunkových organel
-syntéza mitotického aparátu (tubulín, kinetochórové vlákna)
-V tomto štádiu sa nachádza kontrolný uzol  rozhodnutie o vstupe bunky do mitózy

49. MITOTICKÁ FÁZA (mitóza)
-trvá asi 10% bunkového cyklu (1-1,5 hod.), dĺžka trvania je konštantná
PROFÁZA
-rozsiahle prestavby v cytoplazme a jadre bunky. V cytoplazme sa centriol rozdelí na dve časti, kt. putujú k pólom bunky. Tvorí sa mitotický aparát a ku koncu profázy sa vlákna deliaceho vretienka pripájajú ku kinetochóru.
V jadre sa stráca jadierko, chromozómy sa dehydratujú a špiralizujú – stávajú sa viditeľnými. Neskôr na konci profázy sa stráca jadrová membrána, kt. sa stáva súčasťou ER.
Trvanie: 30 min.

50. METAFÁZA
-chromozómy sa ešte viacej kondenzujú a stávajú sa viditeľnejšími
V dôsledku pripojenie mikrotubúl deliaceho vretienka sú chromozómy stabilizované v tzv. rovníkovej rovine. Chromatidy sú stále spojené v mieste centroméry.
Trvanie: 3 min.
ANAFÁZA
-pozdĺžne rozdelenie chromozómu na chromatídy, kt. reprezentujú chromozómy budúcich dcérskych buniek. Rýchlosť pohybu chromozómov 1 mikrón/s.
Trvanie: 5 min.

51. TELOFÁZA
Strata – degradácia – mitotického aparátu, proces depolymerizácie proteínov
dekondenzácia a hydratácia chromozómov – premena na chromatín
tvorba jadrovej membrány z ER
vydiferencovanie jadierka
Trvanie: 20 min.
CYTOKINÉZA
Cytokinéza je proces, pri ktorom sa materská bunka rozdelí na dve bunky schopné samostatnej existencie. Cytokinézu považujeme za samostatnú fázu bunkového cyklu, pretože nemusí stále prebiehať na konci M-fázy, ale môže byť, z hľadiska časového rozvrhu cyklu, „preradená“ do priebehu už nasledujúceho cyklu alebo sa nemusí vôbec uskutočniť (vznikajú tak viacjadrové bunky).

52. DĹŽKA TRVANIA BUNKOVÉHO CYKLU U EUKARYOTOV
Organizmus G1 S G2 M celková dĺžka
Ľudský hod.
Rastlinný hod.
Kvasinky min.

53. Kontrola bunkového cyklu
Normálny vývoj a rast organizmu počas jeho ontogenézy je zabezpečený prostredníctvom mechanizmov, kt. kontrolujú bunkové delenie.
embryonálny vývoj  intenzívne bunkové delenie
postembryonálny vývoj  rýchlosť delenia buniek sa mení (v bunkách niektorých tkanív a orgánov sa môže dočasne zastaviť). Niektoré bunky strácaju schopnosť delenia úplne (ery, leu, neuróny). Niektoré bunky zostávajú v G0 štádiu, t.j. nepripravujú sa na bunkový cyklus a le schopnosť delenia si ponechávajú.
Mechanizmy bunkového delenia:
genetické
negenetické

54. Genetická kontrola
- uskutočňuje sa pomocou génov a ich produktov (polypeptidy, enzýmy a hormóny). Procesy bunkového delenia môžu byť stimulované (pozitívna kontrola) alebo inhibované (negatívna kontrola).
Pozitívna kontrola bunkového delenia
v zmysle stimulácie bun. delenia prostredníctvom produktov iných buniek (signály), kt. sú spracované receptormi:
-mitogény – rastové proteíny (fytohemaglutinín)
-rastové hormóny – somatotropín – hypofýza
tyroxín – štítna žľaza
testosterón, estrogény
erytropoetín – obličky
rastové faktory (EGF, IL-6…)

55. Reakcia signál – receptor aktivuje gény pre produkciu proteínov, kt
Reakcia signál – receptor aktivuje gény pre produkciu proteínov, kt. pozitívne alebo negatívne kontrolujú procesy delenia. Okrem horeuvedených stimulátorov gény riadia produkciu cytokínov a cyklín závislých kináz.
PROTOONKOGÉNY
gény, ktoré produkujú proteíny s pozitívnou riadiacou činnosťou. Mutácie týchto génov vedú k vzniku onkogénov  nádorové bujnenie

56. Negatívna kontrola bunkového delenia
charakteristická inhibíciou bunkového delenia. Génové produkty inhibujú bunkové delenie, ak toto nie je žiadúce pre organizmus.
TUMOR SUPRESOROVÉ GÉNY (p53, retinoblastóm)
tieto kontrolujú bunkové delenie tak, že ho zastavujú v G1-štádiu a bunka nevstupuje do S-štádia.
Pri mutácii génu pre p53, gén produkuje neaktívny proteín, kt. nie je schopný udržiavať inhibíciu bunkového delenia. Bunka napriek tomu, že organizmus to nepožaduje, vstupuje do S-fázy  proces karcinogenézy, iný príklad kožné ochorenie psoriáza – nadmerná produkcia epidermálnych buniek

57. Schéma kontroly bunkového cyklu:

58. Negenetická kontrola
Chemické faktory: pH, koncentrácia iónov, metabolity, pO2 (hypoxia v nadmorskej výške)
Fyzikálne faktory: teplota, žiarenie, kontaktná inhibícia