1. B ćelijski receptor Humoralni imunskog odgovora

2. Lokalizacija i produkcija imunoglobulina
Antitela su specifična za individulane epitope
Membranska forma je prisutna na B ćelijama
Vezivanje Ag za B ćelije stimuliše produkciju At

3. Struktura BCR
Fab Fc

4. Anti-parallel B-strands
Loop region

5. Origin of B cells and organ of B cell
maturation
Transfer marked fetal
liver cells
Mature marked
B cells
in periphery
Normal bone marrow
No Mature
B cells
Defective bone marrow
B cell development starts in the fetal liver
After birth, development continues in the bone marrow

6. B cell development in the bone marrow
Regulates construction of an antigen receptor
Ensures each cell has only one specificity B
Checks and disposes of self-reactive B cells B
Exports useful cells to the periphery B
Provides a site for antibody production B
Bone Marrow provides a
MATURATION & DIFFERENTIATION MICROENVIRONMENT
for B cell development

7. Scheme of B Cell Development in the Bone Marrow
Immature & mature B
Central Sinus
E n d o os t e u m
Progenitors
Pre-B X
Stromal cells X X
Macrophage

8. Stromalne ćelije kostne srži su odgovorne
za razvoj B limfocita
1. Specific cell-cell contacts between stromal cells and developing B cells
Cell-cell contact
Secreted
Factors - CYTOKINES
2. Secretion of cytokines by stromal cells B
Stromal cell
Types of cytokines and cell-cell contacts needed at each stage of differentiation are different

9. Stages of B cell development
Stem Cell
Early pro-B cell
Late pro-B cell
Large pre-B cell
Peripheral
Small pre-B cell
Immature B cell
Mature B cell
Each stage of development is defined by rearrangements of IgH chain genes, IgL chain genes, expression of surface Ig, expression of adhesion molecules and cytokine receptors

10. Cytokines and cell-cell contacts at each stage of differentiation are different
Stem
Early pro-B
Kit
Receptor Tyrosine
kinase
Stem cell factor
Cell-bound growth
factor
VLA-4
(Integrin)
Cell adhesion
molecules
VCAM-1
(Ig superfamily)
Stromal cell

11. Cytokines and cell-cell contacts at each stage of differentiation are different
Interleukin-7
receptor
Interleukin-7
Growth factor
Early pro-B
Late pro-B
Pre-B
Stromal cell

12. Stages of differentiation in the bone marrow are
defined by Ig gene rearrangement
Pre-B cell
receptor
expressed
B CELL STAGE
IgH GENE
CONFIGURATION
Stem cell
Early pro-B
Late pro-B
Large pre-B
Germline
DH to JH
VH to DHJH
VHDHJH
Ig light chain gene has not yet rearranged

13. Transiently expressed when VHDHJH CHm is productively rearranged
B cell receptor
CHm
Heavy chain
VHDHJH
Light chain
VLJLCL
VpreB l5
Iga & Igb signal
transduction
molecules
Transiently expressed when VHDHJH CHm is productively rearranged
VpreB/l5 - the surrogate light chain, is required for surface expression
Ligand for the pre-B cell receptor may be galectin 1, heparan sulphate, other pre-BCR or something as yet unknown

14. Ligation of the pre-B cell receptor
1. Suppresses further H chain rearrangement
2. Triggers entry into cell cycle
Large
Pre-B
Unconfirmed ligand of pre-B cell receptor
1. Ensures only one specificty of Ab expressed per cell
Stromal cell
2. Expands only the pre-B cells with in frame VHDHJH joins
ALLELIC EXCLUSION
Expression of a gene on one chromosome prevents expression of the allele on the second chromosome

15. Evidence for allelic exclusion
ALLOTYPE- polymorphism in the C region of Ig – one allotype inherited from each parent
Allotypes can be identified by staining B cell surface Ig with antibodies
a/a
b/b
a/b Y B a Y B b Y B a Y B b
AND Y B a b
Suppression of H chain rearrangement by pre-B cell receptor prevents expression of two specificities of antibody per cell

16. Allelic exclusion prevents unwanted responses
One Ag receptor per cell
IF there were two Ag receptors per cell Y B Y
Self antigen
expressed by
e.g. brain cells B Y
S. aureus
S. aureus Y
Anti
S. aureus
Antibodies Y
Anti
brain
Abs Y
Anti
S. aureus
Antibodies
Suppression of H chain gene rearrangement
ensures only one specificity of Ab expressed per cell.
Prevents induction of unwanted responses by pathogens

17. Allelic exclusion is needed for efficient clonal selection
Antibody
S. typhi
S. typhi
All daughter cells must express the same Ig specificity
otherwise the efficiency of the response would be compromised
Suppression of H chain gene rearrangement helps prevent the emergence of
new daughter specificities during proliferation after clonal selection

18. Wu-Kabat plot
A Wu and Kabat plot, or variability plot, is generated from the amino acid sequences of related proteins by plotting the variability of the sequence against amino acid residue number. Variability is the number of different amino acids observed at a position divided by the frequency of the most common amino acid.
Wu-Kabat index Examples:
The lowest ratio: = 1/1
The highest ratio: = 20/0.05
A characteristic ratio for a CDR:
= = 10/0.2
= = 12/0.15

19. Wu-Kabat hypervarijabilna mapa
Ove mape pokazuju da unutar vrste konstanti regioni ne variraju od Ig do Ig istog izotipa (to se očekuje za sve proteine).
U varijablnom (V) regionu, postoji varijabilnost u skoro svakoj amino kiseliniskoj poziciji. Postoje oblasti hipervarijabilnosti (hipervarijabilni regioni-HV). Drugi varijabilni delovi V regioni su označeni kao framework (FR).

20. Ispostavilo se da CDR i HV-regiona čine iste amino kiseline.
Varijabilnost vs. 3-D struktura
X-ray kristalografija je pokazala koje AK formiraju antigen-kontaktne rezide i označene su kao regioni koji određuju komplementarnost (engl, complementarity determining regions, CDR). Postoje po tri CDR u svakom varijabilnom regionu.
Ispostavilo se da CDR i HV-regiona čine iste amino kiseline.
Framework regions (FR) igraju ključnu ulogu u oblikovanju antigen-vezujužeg mesta i na taj način, zajedno sa HV regionima, su ključni u određivanju specifičnost antitela

21. U varijabilnim regionima i teškog i lakog lanca postoji varijabilnost u gotovo svakoj poziciji i postoje hipervarijabilni regioni

22. Mehanizmi prepoznavanja epitopa
Linearni i diskontinuirani epitopi
Multivalenti antigeni
Polimerna antitela
Mehanizam vezivanja epitopa

23. Stvaranje raznovrsnosti Ig molekula na B ćelijama
- Jedinstvena organizacija
- Samo B ćelije mogu da eksprimiraju Ig protein
- Genski segmenti
k l-laki lanac
, , , ,  - težak lanac
prisutni na tri hromozoma

24. Rearanžman gena tokom razvoja B ćelija
Hromozom 2 – k laki – 40V x 5J x 1C = 200
Hromozom 22 – l laki – 30V x 6J(C) = 80
Hromozom 14 – teški - 200V x 20D x 6J = = 9,1 x 106 +
Kodiranje konstantnih delova 9C (a1, a2, g1, g2, g3, g4, m, d, e) 108

25. Koncept rearanžiranja gena Germline configuracija
Genski segmenti treba da se rearanžiraju za ekspresiju
Sekvencijalno raspoređeni
Pojavljuje se u prekursorima B ćelija u kostnoj srži
Raznovrsnost nastaje PRE izlaganja antigenu

26. Rearanžiranje gena za težak lanac

27. CDR1 i CDR2
CDR3

28. Rearanžiranje gena za laki lanac

29. CDR1 i CDR2
CDR3

30. Mehanizam rearanžiranja gena za BCR
Signalne sekvence za rekombinaciju (engl. recombination signal sequences , RSS) direktno rekombinovanje
V i J (L lanac)
V D J (H lanac)
RSS tipovi sastoje se od:
- nonamera (9 baznih parova)
- heptamera (7 baznih parova)
- spacer
- Dva tipa: [7-23-9] i [7-12-9]
Odlike RSS:
- prepoznavanje mesta za enzime koji katalizuju rekombinacije
- rekombinacije se dešavaju po tačnom redu
(pravilo 12/23)

31. Sekvence od 12- i 23-bp odgovaraju jednom tj dva okreta DNK heliksa; to je razlog da su ove sekvence označene kao one-turn i two-turn RSS.

32. Mehanizam rearanžiranja gena za BCR
V(D)J rekombinaze: sve proteinske komponente koje posreduju u rekombinovanju
RAG kompleks: Recombination Activating Genes (RAG-1 i RAG-2) kodiraju RAG proteine samo u limfocitima, plus drugi proteini
Rekombinacija se dešava samo vezivanjem dva različita RSS za dva RAG kompleksa (pravilo 12/23 rule)
Sečenje DNK formira jednolančanu šnalu i šeče u heptamernoj sekvenci
Enzimi koji seku i popravljaju nedostatke uvode spojnu raznovrsnost

33. Spojna
raznovrsnost
Rekombinacije +

34. Kako se rekombnacije dešavaju baš na pravom mestu?
Rearanžiranje gana se dešava u RSS

35. Spojna raznovrsnost
Nukleotidi ubačeni u prekide nastale rekombinacijom u kodirajući spoj odgovoran za CDR3 lakog i teških lanaca
- V i J lakog lanca
- (D i J) ili (V i DJ) teškog lanca
P nukleotidi stvaraju kratke palindromske sekvence
N nukleotidi se nasumično dodaju – ovi nisu kodirani
Spojna raznorsnost učestvuje sa 3 x107 u ukupnoj raznovrsnosti!

36. Spojna fleksibilnost prilikom spajanja Ig genskih segemenata može da bude produktivan i neproduktivan

37. Stvaranje raznovrsnosti antitela
Multipli germ-line genski segmenti
Kombinatorno VDJ spajanje
Spojna fleksibilnost
Dodavanje P nukleotida
Dodavanje N nukleotida
Somatske hipermutacije
Kombinatorno povezivanje lakih i teških lanaca

38. Kako nastaje kombinatorna raznolikost?

39. Terminalna deoksinukleotid transferaza (TdT)
P i N nukleotidi
Dodavanje komplementarnih nukleotida (P-addition) delovanjem enzima za reparaciju nastaju palindromske sekvence nazvane P-nukleotidi
Terminalna deoksinukleotid transferaza (TdT)
Kratke AK sekvence koje nisu kodirane germ-line V,D, J genskim segmentima

41. Izvori varijacija sekvenci u CDR regionima
gena za lake i teške lance Ig

42. Stvaranje Ig raznovrsnosti pre susreta sa Ag
Nasumična kombinacija V i J (L lanac) i V, D, J (H lanac) regiona
Spojna raznolikost nastala dodavanjem P i N nukleotida
Kombinatorno povezivanje lakih i teških lanaca
(svaki funkcionalni laki lanac je spojen sa različitim funkcionalnim teškim lancem ivice versa)

43. Ekspresija BCR na B ćelijama

44. Stvaranje BCR-a (IgD i IgM)
Rearanžman VDJ teškog lanca donosi genski promotor blizi C i C
Oba IgD i IgM su simultano eksprimirani na površini B celije kao BCR
Alternativnim splicingom primarnog transkripta stvara se IgM ili IgD
Naivne B ćelije su rani stupanj B ćelija koje se još nisu susrele sa antigenom i eksprimiraju IgD i IgM

45. Alternativnim splicingom primarnog transkripta stvara se IgM ili IgD
Isti primarni RNK transkript
Različita obrada transkripta (mRNA)
IgM i IgD su koeksprimirani na većini zrelih naivnih B ćelija (ćelija može da stvara IgM i IgD u isto vreme)

46. Ig imaju i membransku i sekretornu formu.
Obrada RNK određuje koja forma će biti napravljena za transkripciju
SC=secretion coding
MC=membrane coding
Isti primarni transkript
Različito obrađeni transkripti

47. BAFF / Blys and B cell survival
Member of TNF family
Made by stromal cells, macrophages, DCs
BAFF-receptor constitutively expressed on B cells
BAFF also binds TACI and BCMA
APRIL is a second TACI, BCMA ligand
Critical role in B cell homeostasis
BAFF knockout has ~100x less B cells and is less able to mount antibody responses
BAFF over-expression increases total B cell numbers and promotes autoantibody production
BAFF serum levels elevated in lupus
Stromal cell, MØ, DC
BAFF
B cell
BAFFR
BCMA
TACI
NFkB (alternative &
classical pathways)
-> Bcl2, Pim, other
-> Cell Survival

48. BAFF/Blys is necessary for B cell survivalMØ
BAFF
(BAFFR mutant)
B cell
BAFFR
BCMA
TACI
from Schiemann et al., Science 293, 2111 (2001)

49. Promene u strukturi antitela tokom imunskog odgovora

50. Izotipsko prekopčavanje
IgM je prvo At koje se sekretuje u imunskog odgovora
Izotipovi sa boljom efektorskom funkcijom se produkuju od strane aktiviranih B ćelija
Rearanžman DNK koristi SWITCH regione
- svakom C genskom segmentu prethodi switch sekvenca (osim 
- počinje se sa  genom pa ide bilo koji drugi C gen
Regulacija citokinima produkovanim od strane T ćelija

51. Izotipsko prekopčavanje

52. Regulacija transkripcije gena za Ig
Tri klase cis regulatornih sekvenci u DNK regulišu tranksripciju imunoglobulinskih gena

53. Genska konverzija kod ptica, zečeva i drugih vrsta je mehanizam kojim se stvara primarni repertoar At, nisu VJ i VDJ rearanžmani
Kod ljudi i miševa, VJ i VDJ rearanžman za prim‚arni repertoar i genska konverzija (diverzifikuje) specifičnost primarnog repertoara

54. VJ i VDJ rearanžirani Ig gena se dalje menjaju sledećim mehanizmima
Somatske mutacije povećavaju afinitet
Promene u konstantnom regionu utiču na funkciju i distribuciju.
Promene u varijabilnom regionu utiču na vezivanje Ag

55. Somatske hipermutacije i sazrevanje afiniteta

56. Figure 2-32
This last step is why a plasma cell cannot switch.

57. Stvaranje raznovrsnosti B ćelija (BCR)
Raznovrsnost pre izlaganja antigenu (antigen nezavisna)
- nasumične rekombinacije
- spojna raznovrsnost
- kombinatorno povezivanje
Raznovrsnost posle izlaganja antigenu (antigen zavisna)
- prekopčavanje ka sekretornim At
- somatske hipermutacije
- afinitetno sazrevanje
- izotipsko prekopčavanje

58. Fleksibilnost molekula antitela