1. HIGH PRESSURE LIQUED CHROMATOGRAPHY (HPLC)
Valeria Feinshtein

2. מבוא
כרומטוגרפיה (Chromatography) היא שיטה בכימיה אנליטית המאפשרת הפרדה של חומרים המצויים בתערובת, זיהויים וקביעת כמוּתם.
פרוש המילה – הפרדת חומרים צבעוניים (מהפרדת מצויים צמחיים).
השיטה מתבססת על יכולת ספיחה שונה של חומרים על פני חומרים מספחים: כל חומר בתערובת נספח בחוזק שונה לחומר המספח וכך נוצרת ההפרדה.

3. שיטות כרומטוגרפיה על נייר :
משתמשים בנייר סינון רגיל. מטפטפים טיפה מן התערובת על הנייר ומכניסים אותו לנוזל ההפרדה, כך שהנוזל אינו מגיע עד לטיפה.
הנוזל מתחיל לעלות למעלה בכוח הנימיות, ו"סוחף" איתו את חומרי התערובת. ככל שחומר מסתפח חזק יותר לנייר, כך הוא יעלה פחות, ולהפך.
משווים לקונטרול ידוע.

4. TLC = Thin Layer
Chromatography
שיטה דומה מאוד לכרומטוגרפיה על נייר, רק במקום הנייר משתמשים בחומר סופח כגון סיליקה או אלומינה על משטח קשה כגון זכוכית או אלומיניום.

5. כרומטוגרפית עמודה כרומטוגרפיה בעמודה
זיקה : שימוש עיקרי בהפרדת חלבונים. דוגמא: מילוי עמודה (קולונה) בחומר מספח, וזו תהיה הפאזה הנייחת. אליה ניתן לחבר רצפטור שיקשור את החלבון הרצוי. מזליפים את התערובת הנוזלית = הפאזה הניידת ובה התערובת על הפאזה הנייחת, היא מחלחלת דרך העמודה, כאשר החלבון הרצוי נקשר לרצפטור ונשאר בעמודה.
ביצוע אילוציה עם חומר אשר יספח עליו חזק יותר את החלבון.

7. 2. שיטות נוספות דומות :
שחלוף יונים (הפרדה על פאזה נייחת "ממולאת" ביונים שמשתחלפים עם היונים שבתערובת הניידת).
הפרדה לפי גודל (לדוגמא: פאזה נייחת עם פורות/ כדורים בגדלים שונים, כך רק חומר בגודל מסוים יוכל לעבור).

8. שיטות מתקדמות:
כרומטוגרפיה גזית.
כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה.

9. על מנת להבין היטב את השיטות המתקדמות, נלך כמה צעדים אחורה....

10. Direct Phase או Reverse Phase ???
הפאזה הנייחת המקובלת :
סיליקה SiO2 או אלומינה Al2O3. סופחות חומרים פולאריים. ככל שהחומר פולארי יותר, נספח חזק יותר.
2. ספיחה לא ספציפית. שליטה על הספיחה ניתן לקבל ע"י הוספת סולבנטים שונים. לדוגמא:
הקסן – לא פולארי, אילוציה איתו תביא ליציאת החומרים הלא פולאריים.
אלכוהול – פולארי ביותר, אילוציה איתו תביא ליציאת החומרים הכי פולאריים.
שילובים שונים בין סולבנטים שונים בעלי פולאריות שונה, יאפשרו הפרדה של תערובות. (דוגמא בסוף המצגת).

11. החסרונות של ה- Direct phase chromatography
בעיה 1: המים ממיסים אותה והורסים אותה.
בעיה 2: ככל שהחומר שומני יותר הוא יצא מהר יותר מהמערכת, והחומרים הפולאריים נתקעים הקולונה לזמן ממושך. רוב התרופות – הן מולקולות פולאריות.
בעיה 3: שמירה על סולבנטים בצורה אל מיימית קשה ויקרה למדי.

12. בשיטת ה- Reverse: הסיליקה עברה תהליך אלקילציה.
מוספות קב' פחממניות C4, C8, C18 : (וריאביליות).
כך הפאזה הנייחת מוגנת מפני פרוק והופכת לליפופולית.
החומרים הפולאריים יוצאים ראשונים (הפוך למה שראינו קודם). הבעיות שהוזכרו קודם לכן נפתרו.

13. כיום כמעט ואין שימוש לקולונות העמודה, ונהוג לעבוד בלחצים גבוהים בכרומטוגרפיה.
סיליקה שעברה אלקילציה והוכנסה לקולונה – מייד תדחס בהפעלת לחץ גבוה.
פתרון לבעיה זו: כדורי זכוכית עמידים ללחץ, מצופים בסיליקה שעברה אלקילציה. גודל הכדוריות וריאבילי: 3,5,10mm .
כיום הפאזה הנייחת הנפוצה ביותר – C18 : כדוריות זכוכית מצופות סיליקה, אשר עברה אלקילציה עם שיירים פחממניים באורך C18.

14. precolumn
זו מערכת ה HPLC
נעבור מרכיב מרכיב ונפרט קצת

15. הפאזה הניידת :
סולבנטים שונים המוזרמים למערכת בלחץ שנקבע.
פאזה ניידת אשר מוזרמת בריכוז קבוע למערכת – איזוקראטית. טובה להפרדת חומרים לפי הודרופוביות/ הידרופיליות ( FQ לדוגמא).
פאזה ניידת אשר מוזרמת בריכוז משתנה – גראדיאנט. טובה להפרדת תערובת חומרים אשר זהים בבסיסם, אך טעונים שונה. (לדוגמא: cAMP,cADP,cATP).

16. הזרקת הפאזה הניידת למערכת:
ישנם כמה אמצעים בעזרתם ניתן להזריק את הפאזה הניידת למערכת :
1. Reciprocating Piston Pumps : פיסטונים אשר מתמלאים ומזריקים את הנוזל במהירות גבוהה. המילוי לוקח msec (אין זרימה בזמן זה). נותן "רעש רקע" במערכת.
2. Syringe Type Pumps : מזרק עם נפח קבוע, אשר ממולא בתחילת האנליזה, עם נפח המתאים לאותה אנליזה בלבד. טוב עבור אנליזות רגישות במיחד.
וישנן משאבות משולבות עם לחץ בגז בשימוש תעשיתי.

17. קולונות USES COLUMN/MOBILE PHASE HPLC METHOD
NEUTRAL OR NONIONIZED COMPOUNDS
C-18, C-8
AQUES /ORGANIC
REVERSE PHASE
MIXURES OF INORGANIC IONS,
Nucleic acid
ANION OR CATION EXCHANGE,
AQUES MOBILE PLUS BUFFER
ION-EXCHANGE HPLC
High-molecular-weight such proteins and synthetic polymers
Polystyrene or silica
Aqueous or organic
SIZE-EXCLUSION HPLC
קולונה טעונה ביונים שליליים תפריד בין חומרים טעונים חיובית, ולהפך.
Precolumn : תוספת לפני הקולונה, אשר נועדה להגן על ניקיון הקולונה. ניתנת להחלפה, זולה יחסית.

18. גלאים Ultra-Violet (UV) Fluorescent Radiochemical Electrochemical
Near-Infra Red (Near-IR)
Mass Spectroscopy (MS)
Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
Light Scattering (LS)

19. הגלאים מותאמים לתכונות החומרים המופרדים.
למשל :
עבור חומר עם בליעה פלואורוסנטית כמו FQ – נשתמש בגלאי....
עבור חומר עם בליעה בתחום UV, כמו Nitrofurantoin, נשתמש בגלאי...
עבור חומר המסומן באיזוטופ ראדיואקטיבי, נשתמש בגלאי...

20. Recorder = רשם
מחשב אשר מכמת את הסיגנל המגיע מהגלאי, ומוציא פלט בצורת פיקים. גודל הפיק פרופורציונלי לריכוז/כמות החומר.
הפרמטרים החשובים:
RT – זמן יציאת החומר
מהמערכת. ישאר קבוע
בתנאים קבועים,
וכל יכול לאפיין חומר.
סימטריית הפיק ±1.
סימטריה : גובה המורד לאמצע הבסיס. מחלק הבסיס לשני חלקים. המנה צריכה להיות בערך 1

21. רצולוזיה - מחושבת לפי המשוואה הבאה :
Rs=(T2-T1)/[0.5(W1+W2)
Rs≥ 1.5; complete separation
T – זמן יציאה, W = רוחב בסיס פיק.

22. חישוב גודל פיק איך מחשבים גודל פיק אם הרשם הפסיק לעבוד?
גובה * רוחב הבסיס בחצי הגובה!

23. חשוב להתאים את הרכב הפאזה הניידת להפרדה הטובה ביותר. לדוגמא :
בתמונות רואים את השפעת הרכב הפאזה הניידת על ההפרדה. תראו איך שהפיקים מופרדים יפה בתמונה העליונה, ואיך בתמונה התחתונה יש רק פיק אחד – שהוא איחוד של כל הפיקים.

24. בסך הכל ישנן כמה פרמטרים רצויים בעבודה עם HPLC :
רזולוציה : מעל 1.5
זמן הפרדה/ הרצה = עד 10 ד'. אחרת- זו נהיית עבודה מפרכת ומעייפת...
רעש רקע – לא יותר מעד 5% מגודל הפיק.
לשמור על קולונה נקייה ( הלחץ מראה את ניקון הקולונה : ככל שהיא סתומה ומלוכלכת יותר – ההתנגדות במערכת עולה והלחץ עולה ).
אם התנאים לא כאלה – התוצאות לא מהימנות, והעבודה נעשת במערכת מלוכלכת והיא יכולה לההרס.

25. גודל השיירים הפחממניים. גודל הכדוריות. עבודה בלחצים שונים.
לסיכום:
פרמטרים משתנים:
גודל השיירים הפחממניים.
גודל הכדוריות.
עבודה בלחצים שונים.
גלאים שונים.
סולבנטים שונים.
כל אלה נותנים וריאביליות גדולה מאוד ויכולת הפרדה טובה ויעילה של חומרים שונים.
פאזה נייחת

26. שימושים של HPLC ברוקחות : משתמשים בשיטה להפרדה וכימות חומרים.
כמו כן לבדיקת ניקיון חומרים שונים. דוגמא :
מפעל X מייצר עבור מפעל Y את החומר הפעיל בתרופה ASPIRIN. מפעל X מעוניין לבדוק את ניקיון החומר המסופק לו, לפני שיתחיל את ייצור התרופה.
שימוש רפואי: בדיקה של רמות תרופה Z בדמו של חולה. ( לדגמא: ניטור חולה שאושפז עקב זיהום חמור בדרכי השתן והכליות, אשר מקבל Levofloxacin I.V.).

27. כרומטוגרפיה בגז המערכת דומה ל - HPLC, אבל :
הפאזה ניידת – גזית. משתמשים בגז אינרטי כגון N2, He, Ar.
התערובת המוזרקת הופכת לגז.
כאשר החומרים יוצאים מהקולונה הם נשרפים, ולפי כמות הפחמן הדו-חמצני המתקבל משרפת החומר מתבצע הכימות. (כמות הפחמן הדו-חמצני פרופורציונלית לכמות החומר הנבדק).
השיטה טובה עבור חומרים אורגניים.

28. תודה על ההקשבה!