1. נושא העבודה :
חלבוניים התלויים בנתיב ה- Signal Recognition Particle (SRP) בטריפנוזומטידים

2. תקציר
מחקרים שונים הראו כי ל-SRP תפקיד בהובלת חלבונים משני סוגים אל ה-Endoplasmic Reticulum (ER), חלבונים הנושאים רצף מיוחד הנקרא רצף ההכרה (Signal Sequence-SS) וחלבונים ממברנליים אינטגרליים (חלבונים המשולבים בממברנה).
מחקר קודם שנעשה במעבדתנו בטריפנוזומטידים הראה כי חלבונים נושאי רצף ההכרה אינם תלויים באופן ישיר בחלקיק ה-SRP. פגיעה בחלקיק לא גרמה לשיבוש המעבר של חלבונים נושאי SS אל ה- ER.
לאור תוצאות אלה שאלנו

3. איזה מהחלבוני הטריפנוזומטידים תלויים באופן ישיר ב - Signal Recognition Particle ?
השערתנו היא כי חלבונים ממברנליים אינטגרליים –פוליטופיים, הם אלה שתלויים באופן ישיר ב-SRP.

4. כדי לאשש השערה זו בחנו שלושה כיוונים:
חיפשנו שינויים בתבנית החלבונים בין טפילים בהם נעשתה פגיעה ב-SRP ובין טפילים בהם לא הייתה פגיעה בו, (החיפוש נעשה בעזרת שימוש באנטיסירה מחיה חולה שהודבקה בטפיל הגורם למחלת השינה).
בחנו את השינוי בחלבון פוליטופי ספציפי – Nucleoside transporter במהלך הפגיעה ב-SRP.
הפרדנו בין חלבונים ממברנליים וחלבונים ציטופלסמטיים ואותם חלבונים שעברו שינוי לאחר הפגיעה ב-SRP אופיינו באמצעות מס-ספקטרומטר.

5. התוצאות שהתקבלו הראו כי:
אכן יש הבדל בתבנית החלבונים בין הטפילים בהם הייתה פגיעה ב-SRP ובין כאלה שלא הייתה פגיעה שכזו.
כמות החלבון nucleoside transporter ירדה משמעותית בעקבות הפגיעה ב-SRP.
החלבונים שעלו מאנליזת מס-ספקטרומטר היו חלבונים השייכים לתהליכים מטבוליים בתא, Arginine kinase ו-Enolase.

6. מבוא
טריפנוזומטידים -
יצורים חד תאיים שהתפלגו מאוד מוקדם באבולוציה מענף אאוקריוטים ונחשבים ליצורים אאוקריוטים ירודים.
הם כוללים מספר זנים – כולם טפיליים התוקפים בעלי חוליות וגורמים למחלות קשות בחיות בר, משק ובאדם.
בין המחלות שהם גורמים ניתן לציין את "מחלת השינה באדם" , נגרמת ע"י הטפיל Trypanosoma brucei gambiense, מחלת "Chagas" הפוגעת בלב ונגרמת ע"י הטפיל Trypanosoma cruzi וכן מחלות נוספות.

7. המחלות הנגרמות מטפילי הטריפנוזומטידים לסוגיהן נפוצות מאוד בעיקר במדינות המתפתחות, הן גורמות לפגיעה בנפש ולפגיעה כלכלית חמורה אך למרות זאת אין עדין טיפול יעיל כנגדן.
60 מליון איש חשופים כל שנה לטפיל T.brucei וכחצי מיליון נדבקים במחלת השינה הנגרמת על ידו.
120 מליון חשופים לטפיל T.cruzi וכ-16 מליון חולים במחלת “Chagas" כל שנה.
350 מליון איש חשופים לטפיל הלישמניה וכ-12 מליון נדבקים במחלות השונות שנגרמות מטפיל זה.

8. ישנם שתי קבוצות טפילים עם מחזור חיים שונה:
א. טפילים מונוגנטיים – מתפתחים ומתרבים רק בחרקים כגון: Leptomonas collosoma.
ב. טפילים דיגנטיים – נמצאים בצורת חיים אחת בגופם של חרקים מוצצי דם וצורת חיים אחרת ברקמות או בדם של בעלי חוליות. מחזור החיים של טפילים מסוג זה הוא דו-שלבי שלב procyclic בחרק ושלב metacyclic ביונק (ב-T.brucei צורה זו הופכת לצורת bloodstream).
הטפיל מתרבה ברביה אל מינית במעי הזבוב ועובר לבלוטות הרוק שם הופך לצורת metacyclic
הזבוב מזריק את החרק למאכסן חולייתני בצורת metacyclic בזמן מציצת הדם 
הטפיל עובר לזבוב בזמן מציצת הדם, במעי החרק הוא הופך לצורתו ה -procyclic
הטפיל מתרבה ברביה אל מינית בזרם הדם של החולייתן

9. מנגנונים ייחודיים בטריפנוזומטידים:
Antigenic variation – בזרם הדם הטפיל מכוסה במעטה חלבוני – הנקרא Variant Surface Glycoprotein (VSG).
RNA editing – תהליך המתרחש לאחר/בזמן התעתוק. mRNA מטוכונדיראלי עובר עריכה מחדש ע"י הוספה או החסרה של בסיס U. עריכה זו מתבצעת ע"י gRNA.
Trans splicing- תהליך בו RNA פוליציסטרוני עובר לרצף מונוציסטרוני המקודד לחלבון יחיד.

10. The Signal Recognition Particle
רוב החלבונים המיועדים להפרשה החוצה מהתא או שמיועדים לממברנה צריכים להגיע תחילה אל ה- ER ומשם ליעדם הסופי.
כדי שחלבונים יוכלו לעבור דרך ממברנה הידרופובית משתמש התא בשתי מערכות:
חלבונים צ'פרונים בתהליך הנקרא post-translational translocation.
קומפלקס ה-SRP בתהליך הנקרא co-translational translocation.
קומפלקס ה-SRP משומר בין כל ממלכות החיים

11. רוב החלבונים המופרשים החוצה כוללים בקצה האמיני שלהם רצף ייחודי הנקרא רצף ההכרה – Signal Sequence. בשלב ראשון עם יציאת החלבון מהריבוזום נקשר אליו חלקיק ה-SRP והמשך התרגום נעצר. בשלב שני מכוון כל הקומפלקס (ריבוזום-חלבון מתהווה-SRP) אל ממברנת ה-ER. תהליך זה מצמד בין תהליך התרגום ותהליך ההכוונה ל-ER.
כדי שחלבון יוכל להיכנס למסלול ה-SRP צריכים להתקיים שני תנאים:
רצף ההכרה צריך להכיל רמה מסוימת של שיירים הידרופוביים.
רצף ההכרה צריך לסגל לעצמו מבנה מרחבי של אלפא הליכס.

12. SS
ריבוזום
SRP
GTP
GDP SR
ממברנה
טרנסלוקון

13. מרכיבי ה – SRP:
ביונקים החלקיק מורכב ממולקולת RNA אחת (~300nt., נקראת SRP-RNA) ושישה פוליפפטידים שמתחברים אליה - SRP9,SRP14,SRP19,SRP54,SRP68,SRP72.
בשמרים יש מולקולת RNA אחת (נקראת scR1) ושישה פוליפפטידים כמו ביונקים. Sec65 הוא ההומולוג של SRP19, SRP21 - פוליפפטיד ייחודי לשמרים (SRP9 לא קיים השמרים).
בחיידקים יש מולקולת RNA אחת קטנה (4.5S RNA) ופוליפפטיד אחד, הומולגי ל- SRP54.

14. (Eichler and Moll 2001)

15. SRP בטריפנוזומות:
SRP בטריפנוזומטידים הוא חלקיק ייחודי ממספר סיבות:
1. אזור ה- Alu קצר יותר וקטום, אין למולקולה את הצורה האופיינית של tRNA.
2. במשפחה זו יש שתי מולקולות RNA, האחת הומולוגית לזו של שאר האאוקריוטים והשניה מולקולה קטנה 76 נוקלאוטידים בטפיל T.brucei ו-85 נוקלאוטידים ב- L.collosoma מולקולה זו עוברת אינטראקציה עם מולקולת ה -7SL RNA .
3. מולקולת ה-7SL RNA עוברת בין שתי תצורות שונות בטפיל L.collosoma, 7SL I ו- 7SL II.
בטריפנוזומות נמצאו הומולוגים רק ל-4 פוליפפטידים,SRP19,SRP54,SRP68,SRP72.

16. מבנה SRP טריפנוזומטידי

17. חיוניותו של ה-SRP:
למרות שהחלקיק משומר נמצא כי קיימים הבדלים משמעותיים בין החלבונים שתלויים בו באורגניזמים השונים:
יונקים – הובלת רוב החלבונים המיועדים להפרשה דרך ה-ER או חלבונים המיועדים לממברנה עוברים במסלול ה-SRP.
שמרים – חיוניותו של SRP משתנה בין הזנים השונים. לדוגמא בשמר S.pombe פגיעה ב-SRP הייתה קטלנית לתא, לעומתו בשמר S.cerevisiae פגיעה ב-SRP גרמה לתא להראות "חולה ומסכן" אך בסופו של דבר התא שרד.
חיידקים – פגיעה ב-SRP קטלנית לתא אך מסלול זה חיוני כנראה בעיקר להכוונה של חלבונים ממברנליים, פגיעה בממברנה סופה מוות לתא.

18. מטרת עבודה זו הייתה לנסות לאפיין את החלבונים שתלויים ישירות ב-SRP בטריפנוזומטידים.
השאלה
האם בטריפנוזומטידים במצב הטבעי, חלבונים ממברנליים פוליטופיים הם אלה התלויים ב-SRP (כמו בחיידקים) או גם חלבונים נושאי רצף הכרה תלויים בחלקיק (כמו באאוקריוטים אחרים)?

19. מסלול ה – SRP חיוני לגידול התאים9 7 5 3 1 6 8
Log (cells/ml) WT
-TET
+TET
days
מסלול ה – SRP חיוני לגידול התאים DF
After 10 days (+Tet)
(Liu et al., 2002)

20. p67
(Liu et al .,2002)

21. EP A B

22. באנליזת Western blot כמות וגודל החלבון היו שווים בהשוואה בין תאים מושתקים ולא מושתקים
המסקנה מסדרת ניסויים זו היא, כי חלבונים נושאי רצף הכרה אינם תלויים ב-SRP ועוברים אל ה – ER כנראה במסלול צ'פרוני אלטרנטיבי.

23. השאלה אם כן מיהם החלבונים שתלויים ב-SRP נשארה פתוחה...
השערה:
חלבונים ממברנליים פוליטופיים הם אלה שתלויים באופן ישיר בחלקיק. פגיעה בו תגרום לשינוי הרכב הממברנות בתא. שינוי זה פוגם בתנועת חלבונים שונים בתא ולכן גורם גם לפגיעה במיקומם הסופי של חלבונים נושאי רצף ההכרה ולבסוף למוות.

24. Nucleoside transporter
טפילי הטריפנוזומה אינם מסוגלים לייצר בעצמם פורין ולכן הם סיגלו לעצמם את היכולת לנצל פורין מהמאכסן. המצאות הפורין קריטית שכן היא חיונית בבניית חומצות גרעין.
מקור הפורין בטפיל הוא nucleoside. הכנסת ה - nucleoside לתוך הטפיל מתווכת ע"י טרנספורטרים ייחודיים הנמצאים על ממברנת הטפיל, טרנספורטרים אלה שייכים למשפחת החלבונים הפוליטופיים.

25. TbNT-GFP צביעה חיצונית
כדי להשוות בין רמת ה – GFP בתאים מושתקים ולא מושתקים השתמשנו בשלוש גישות: מיקרוסקופ קונפוקלי, FACS ואנליזת Western blot.
קונפוקלי:
TbNT-GFP צביעה חיצונית
-Tet
+Tet

26. -Tet
GFP-TbNT צביעה פנימית
+Tet

27. FACS:
פלורסנציה
שחור-+Tet
ירוק - -Tet
גודל
שחור-+Tet
ירוק - -Tet

28. Western blot:

29. Northern blot ל-TbNT-GFP
GFP ~2.5kb
rRNA
Tubulin
Et.Br

30. עקומת גידול של T.brucei בטמפרטורות שונות וחלבוני עקה
Wt 27
SL3 27
SL3 34
Wt 34

31. SR - a
kDa
hsp83 84
טובולין 52
SL-3
kDa 84
hsp83

32. SR-a - +
kDa 84
hsp70
SL-3
טובולין 52
kDa 77
hsp70
טובולין 49

33. חלבונים המשתנים במהלך ההשתקה של SRP54
123 77
123 77 40 40 24 24 19 13 19 10 13

34. פרקציונציה של תאי SR-a וצביעת כסף

35. החלבונים שהתקבלו בריצוף הם: Arginine kinase ו- Enolase
שני חלבונים הפעילים בתהליכים מטבולים בתא
Arginine kinase - חלבון בעל פעילות של phosphotransferase.
אנזים זה משפעל מעבר פוספט מ - ATP ל - ארגנינין.
Arginine+MgATP Argininephosphate+MgADP+H+
Phosphoarginine משחק תפקיד חשוב בויסות ריכוז ה-ATP בתא ומשמש כמאגר אנרגיה.

36. Enolase-אנזים המשתתף בתהליך הגליקוליזה ונמצא בציטוזול.
Enolase= 2-phospho-D-glycerate hydrolase המשפעל מעבר דו כיווני של:
D-2-phosphoglycerate (PGA) phosphoenolpyruvate (PEP)

37. תהליך הגליקוליזה בטריפנוזומטידים -

38. Ubiquitin
ויסות תהליכים תוך תאיים מושפע במידה רבה מויסות רמות יציבות של חלבוני מפתח בתא, ויסות זה יכול להתרחש ע"י סינטזה ויצירת חלבונים אך לא פחות מכך ע"י פירוק ועיכול חלבונים.
השאלה אותה בקשנו לבדוק היא האם מערכת ה – ubiquitin/proteasome פעילה בזמן הפגיעה ב-SRP ומזרזת את פירוק החלבונים.

39. (Glickman MH.,2000)

40. Western blot בתאי SR-a עם נוגדן אנטי – ubiquitin ומעכב פרוטאוזום
control

41. מסקנות
בעבודה זו הרחבנו את ההבנה לגבי חלבונים שביגורם מושפע ישירות מפגיעה במסלול ה - SRP. מצאנו כי במהלך ההשתקה של ה – SRP נפגע ייצורו של חלבון ממברנלי בעוד שייצורם של חלבונים נושאי רצף הכרה לא נפגע.
המסקנה מכך היא כי כנראה לא קיים מסלול אלטרנטיבי ליצירת וביגור חלבונים ממברנליים פוליטופיים בטריפנוזומטידים.
התמודדות התא עם מחסור ב - SRP היא בעליה חלקית של חלבונים מסייעים - חלבוני עקה (hsp83 ולא hsp70) וירידה בסינטזת חלבונים חיוניים לתהליכים מטבוליים בתא.
אין עליה בחלבונים המסומנים ב- ubiquitin אלא ירידה ביצור חלבונים בניסיון למנוע את הצטברותם בתא.