1. Mikroorganismu gēnu inženierija
Maris Lazdins
Studiju kurss
Mikroorganismu gēnu inženierija
2017./2018. mācību gada 2. semestris
Māris Lazdiņš
LU BF Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

2. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Kursa struktūra
Kursa apjoms - 4 kredītpunkti;
32 akad. stundas - lekcijas;
4 akad. stundas - divi kontroldarbi:
- viens pēc GI eksperimentu apskata,
- otrs par atsevišķu Vektoru pielietojumu;
28 akad. stundas praktiskie darbi:
- semināri, darbs pie datora,
* Patstāvīgi sagatavoti ziņojumi semināros, atrisināti uzdevumi un veikta GI eksperimenta datorsimulācija
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

3. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Kursa struktūra
Piektdienas
lekcijas telpa :30
praktiskie darbi: - datortelpā :30
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

4. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Kursa struktūra
Definīcijas, vēsture, nozīmīgākie atklājumi, slavenākie zinātnieki pasaulē un Latvijā. GI ētiskie aspekti un drošības tehnika, izplatītākie GI "rezultāti" (ĢMO)
GI eksperimentu shēma. GI izmantojamie enzīmi. Klonējamās DNS iegūšana, vektormolekulas
Gēnu bibliotēku veidošana
Saimniekšūnu ģenētiskā fona nozīme DNS fragmentu klonēšanā
Svešu gēnu ekspresijas iegūšana mikroorganismos un rekombinanto proteīnu izdalīšana un attīrīšana
Dažādu mikroorganismu grupu gēnu inženierija (gram-pozitīvās un gram-negatīvās baktērijas, raugi)
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

5. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Literatūra I
Lekciju materiāli - \\Priede\Grozs\Mikrobiologijas...\ Maris\Gen-inz
Watson et al. Recombinant DNA. 2nd ed. 1992, Sci. Am. Books vai
Уотсон и др. Рекомбинантные ДНК. 1986, Мир
Lewin, B. Genes VI. 1997, OUP
Щелкунов С. Генетическая инженерия. 2004, Сиб. унив. изд.
Jebkura mikrobioloģijas, bioķīmijas un molekulārās bioloģijas grāmata - ievadam
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

6. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Literatūra II
Karcher, S.J. Molecular Biology. A Project Approach. 1995, Academic Press
Bloom et al. Laboratory DNA Science. 1996, Benjamin Cummings
Reed et al., Practical Skills in Biomolecular Sciences. 1998, Longman
Maniatis et al., Molecular Cloning. 1982, CSH
Short Protocols in Molecular Biology. Ed. in Chief Ausubel, F., 1995, Wiley
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

7. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Literatūra III
Basic Cloning Procedures. Ed. Bērziņš, V., 1998, Springer
Zinātniski žurnāli fakultātes bibliotēkā un katedrās - Nature ..., Trends in …, Biotechniques u.c.
Enciklopēdijas, piemēram, MS Bookshelf, MS Encarta, Encyclopaedia Britannica, Wikipedia u.c.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

8. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Literatūra IV
Tīmekļa vietnes:
Nacionālais biotehnoloģijas informācijas centrs - NCBI (ASV) -
Eiropas bioinformātikas institūts - EMBL-EBI (EMBL [21+5 valstis] struktūrvienība; AK) -
Dažādu universitāšu kursu apraksti, lekciju konspekti, laboratorijas protokoli, metodes. Tas viss atrodams izmantojot kādu no meklētājiem - Google u.c.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

9. Rekombinantās DNS tehnoloģija
Gēnu inženierija
(genetic engineering)
Austrumeiropā populārs apzīmējums
Rietumos biežāk lieto:
Rekombinantās DNS tehnoloģija
(recombinant DNA technology)
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

10. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Definīcijas I
Encyclopaedia Britannica:
Mākslīgu manipulāciju, rekombināciju veikšana ar DNS vai citām nukleīnskābēm, to pārveidošana ar mērķi pārveidot kādu organismu vai organismu populāciju.
MS Encarta:
Gēnu inženierija ir organisma ģenētiskā (iedzimtības) materiāla izmainīšana, lai atbrīvotos no nevēlamām pazīmēm vai arī lai radītu jaunas vēlamas.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

11. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Definīcijas II
The American Heritage Dictionary of the English Language, 5rd Ed. 2011:
Dzīva organisma ģenētiskā materiāla struktūras zinātniska pārveidošana. Tā ietver rekombinantu DNS molekulu radīšanu un izmantošanu, tā ir tikusi pielietota baktēriju radīšanai, kas sintezē insulīnu un citus cilvēka proteīnus.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

12. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Definīcijas III
Gēnu inženierija nav zinātne
Gēnu inženierija ir molekulārās bioloģijas, bioķīmijas, mikrobioloģijas, imunoloģijas, virusoloģijas u.c metožu kopums
(biotehnoloģijas virziens) , lai
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

13. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Definīcijas III
iegūtu:
eksperimentam vajadzīgo izejmateriālu,
rekombinantas nukleīnskābju molekulas,
rekombinanto DNS nesošas šūnas,
veidotu DNS bibliotēkas,
iegūtu biotehnoloģiski nozīmīgus organismus ar jaunām īpašībām utt.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

14. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Definīcijas IV
GI metodes pielieto daudzās zinātnes nozarēs, tai skaitā arī zooloģijā, botānikā, fizioloģijā, medicīnā, lauksaimniecībā, biotehnoloģijā, mikrobioloģijā utt.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

15. Mākslīga un mērķtiecīga iejaukšanās –
Ierastā gēnu aprite un mainība dabā
Nodrošina organismu ģenētisko daudzveidību un mainību:
Dzimumprocess
Rekombinācijas
Mutāciju rašanās
arī ģenētiskā transformācija, transdukcija
Mākslīga un mērķtiecīga iejaukšanās –
- gēnu inženierija
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

16. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Dzimumprocess
- vecāku ģenētiskā materiāla skaldīšanās un apvienošanās
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

17. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Dzimumprocess
Meijoze
Shēmā iedomāta šūna
ar divām hromosomām
(2x)1n 1n 2n
(2x)2n 1n 1n
Piemēram, Austrālijā dzīvojošās Myrmecia pilosula
mātītes (citām skudrām vairāk hromosomu) 1n
(2x)1n
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

18. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Genoma kopiju skaits
Prokariotiem raksturīgi: nosacīti 1 hromosomas 1 kopija šūnā
(haploīds genoms)
Plazmīdas, episomas - var nebūt / var būt,
- ja ir - viena veida vai vairāku dažādu veidu,
- kopiju skaits mainīgs.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

19. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Genoma kopiju skaits
Deinococcus radiodurans
Ginesa rekordu grāmatā ierakstīta kā pasaulē izturīgākā baktērija.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

20. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Genoma kopiju skaits
Deinococcus radiodurans
Genomu veido divas cirkulāras hromosomas:
2, bp,
412 Kbp
kā arī viena 177 Kbp liela megaplazmīda un
46 Kbp plazmīda.
Genomā ir aptuveni gēni.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

21. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Genoma kopiju skaits
Deinococcus radiodurans
Stacionārjā fāzē esošajās šūnās parasti ir
- 4 genoma kopijas,
bet šūnās, kuras strauji dalās, pat
genoma kopijas.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

22. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Genoma kopiju skaits
Deinococcus radiodurans
Lielo mikroorganisma izturību nodrošina:
- daudzās genoma kopijas, kā arī
- īpatnējs DNS reparācijas mehānisms
(spēj pārrāvumus hromosomās atjaunot stundu laikā).
Tāpat D. radiodurans šūnās atrastas arī proteīnu sistēmas, kuras no jonizējošā starojuma iedarbības sargā pārējos proteīnus.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

23. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Genoma kopiju skaits
Deinococcus radiodurans
- daudzās genoma kopijas, un
- īpatnējs DNS reparācijas mehanisms
nodrošina homoloģiskās rekom-
binācijas starp identiskajām geno-
ma kopijām,
kā rezultātā iespējams atjaunot nopietni bojātu (fragmentētu) genomu.
Zahradka k. et al. (2006) Reassembly of shattered chromosomes in Deinococcus
radiodurans // Nature. 27 September 2006
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

24. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Genoma kopiju skaits
Metabolisma ziņā ļoti daudzveidīgajai:
(anaerobi fototroheterotrofa;
anaerobi fotoautotrofa;
aerobi hemoheterotrofa;
atmosfēras slāpekli fiksējoša)
purpurbaktērijai Rhodobacter sphaeroides
raksturīgas divas atšķirīgas hromosomas (CI - 3x106 bp un CII - 9x105 bp), kuras papildina 5 dažādas plazmīdas.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

25. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Rekombinācijas
Homologā, simetriskā
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

26. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Mutāciju veidošanās
Nelielā skaitā (fona līmenī):
dabisks process kam pamatā -
- DNS polimerāzes pieļautās kļūdas, kuras rada
nukleotīdu spēja īslaicīgi pastāvēt tautomēru formu veidā.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

27. Rekombinantās DNS tehnoloģija
Gēnu inženierija
Rekombinantās DNS tehnoloģija
DNS fragmentu mākslīga pārnese
- starp jebkuriem organismiem,
- nosakot pārneses sākumu un beigas,
- ietverot in vitro manipulācijas ar DNS,
- arī pievienojot sintētiskus DNS fragmentus.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

28. Gēnu inženierijas attīstības priekšnosacījums:
Gēnu inženierijas attīstības priekšnosacījums:
dzīvās dabas ģenētisko un molekulāro mehānismu, procesu izprašana.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

29. Kas atvieglo gēnu inženierijas veikšanu ?
Molekulāri-ģenētisko mehānismu universālums visā dzīvajā dabā:
- Ģenētisko informāciju kodē nukleīnskābes,
- Ģenētiskā koda principu vienveidība,
- Visi proteīni veidoti no 20 aminoskābēm,
- Līdzība ģenētiskā materiāla darbības pamatmehānismos - replikācijā, transkripcijā translācijā.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

30. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI priekšvēsture I
Gregor Mendel ( )
Liek pamatus ģenētikai kā kvantitatīvai zinātnei
Koncepcija par pazīmi (gēnu) kā diskrētu vienību, kas tiek nodota no paaudzes paaudzei iedzimtības ceļā
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

31. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI priekšvēsture II
Thomas Hunt Morgan ( )
Izstrādā iedzimtības hromosomu teoriju - gēni ir lineāri novietoti noteiktās hromosomās un var būt savstarpēji saistīti (linkage)
Rekombinācija starp diviem viena hromosomu pāra gēniem meijozes laikā liecina par to savstarpējo attālumu un novietojumu
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

32. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI priekšvēsture II
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

33. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI priekšvēsture III
1944. gadā O.T. Avery, C.M. MacLeod un M. McCarty pierāda, ka DNS ir šūnas ģenētiskās informācijas nesējs.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

34. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI priekšvēsture III
Viņi turpina F. Griffith iesāktos Streptococcus pneumoniae ģenētiskās transformācijas pētījumus.
Transformācijas procesu novērš šūnu ekstraktu apstrāde ar:
- dezoksiribonukleāzēm, bet
- nevis apstrāde ar proteāzēm vai
- ribonukleāzēm.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

35. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI priekšvēsture IV
Alfred D. Hershey un
Martha Chase gadā pārliecinoši pierāda, ka iedzimtības materiāls ir DNS.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

36. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI priekšvēsture IV
Eksperimenti ar bakteriofāgu T2.
DNS tika radioaktīvi iezīmēta ar 32P, bet fāga proteīnu apvalks ar 35S.
Tikai vīrusa DNS nonāca šūnā un nodrošināja vīrusa vairošanos.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

37. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI priekšvēsture V
No kreisās: James Watson (1928-) un Francis Crick ( )
Izstrādā DNS dubultspirāles modeli neveicot nevienu pašu eksperimentu. (1953)
Viņu modelis tiek izstrādāts balstoties uz citu zinātnieku eksperimentālajiem datiem (1962)
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

38. GI priekšvēsture V 50 gadi DNS struktūras atklāšanai (2003)
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

39. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI priekšvēsture V
Linus Pauling,
Rosalind Franklin,
Maurice Wilkins,
Erwin Chargaff
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

40. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI priekšvēsture V
Rosalind Franklin ( )
R.F. DNS kristalogrāfijas un rentgenstaru difrakcijas dati ir pamatā Vatsona un Krika DNS dubultspirāles modelim
R.F. tiek uzskatīta arī par vīrusu struktūras pētījumu pamatlicēju
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

41. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI priekšvēsture VI
Robert Holley ( ),
Marshall Nirenberg ( ) un
Har Gobind Khorana ( )
līdz gadam pilnībā atšifrē proteīnu ģenētisko kodu.
(1968)
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

42. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI priekšvēsture VI
Ģenētiskā koda atšifrēšanai izmanto in vitro translāciju par matricas RNS izmantojot sintētiskas RNS ar noteiktu nukleotīdu motīvu secību
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

43. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI attīstībs Latvijā I
Molekulārās bioloģijas un ģenētikas attīstība Latvijā atsākās gadā, kad PSRS PSKP CK oktobra plēnumā tika atcelts ģenētikas un molekulārās bioloģijas aizliegums, kas tika ieviests laikā, kad Trofims Lisenko bija PSRS Zinātņu Akadēmijas
Ģenētikas institūta un Ļeņina vārdā nosauktās Vissavienības Lauksaimniecības Zinātņu akadēmijas direktors ( )
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

44. GI attīstībs Latvijā II
1964. gadā Elmārs Grēns LZA Organiskās sintēzes institūtā nodibina nukleīnskābju pētījumu grupu,
1975. gadā tā tiek pārveidota par laboratoriju,
bet gadā par nodaļu, kas ietver 3 laboratorijas,
1990. gadā izveidojas Molekulārās bioloģijas institūts,
kas gadā tiek pārveidots par LU Biomedicīnas pētījumu un studiju centru.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

45. GI attīstībs Latvijā II
Prof. Elmārs Grēns
Prof. Valdis Bērziņš
Prof. Pauls Pumpēns
Prof. Aleksandrs Cīmanis
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

46. GI attīstībs Latvijā III
Ar gēnu inženieriju Latvijā sāk nodarboties gadā
1980. gadā tiek klonēts pilns hepatīta B vīrusa genoms
1984. gadā tiek atklāts jauns cilvēka interferona gēns IFN-aN
1985. gadā tiek noteikta pilna HBV genoma struktūra
tie gadi - cilvēka interferonu un interleikīnu gēnu klonēšana un ekspresija E.coli šūnās
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

47. GI attīstībs Latvijā IV
Pētniecības iestādes, kurām ir potenciāls GI metožu izmantošanai:
Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrs,
LU Bioloģijas fakultāte,
LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas institūts,
RSU Mikrobioloģijas un virusoloģijas institūts.
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

48. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
GI attīstībs Latvijā V
Vairāk par šī virziena attīstības vēsturi:
Intervija ar profesoru Paulu Pumpēnu krājumā Millenium.
Skats uz Latviju.
Valters un Rapa, 1999
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

49. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML