1. Elektronu transports mitohondriju elpošanas ķēdē: skābekļa reducēšana un protonu translokācija
Elektronu transporta ķēdē notiek skābekļa četrelektronu reducēšana par ūdeni, un elektronu transports ir sajūgts ar protondzinējspēka veidošanu.

3. Citohroma c oksidāzē skābekļa reducēšana ir saistīta ar protonu translokāciju
“vektoriālie protoni”
“ skalārie protoni”

4. Divi protondzinējspēka veidošanās mehanismi, kas saistīti jeb sajūgti ar elektronu transportu, ir:
• “protonu pumpja” jeb konformāciju sūkņa mehanisms; vektoriālie protoni
• tāds red-oks reakciju telpiskais izkārtojums elektronu transporta ķēdē, ka membrānas iekšpusē notiek reducēšanās ar protonu saistīšanu, un/vai ārpusē – oksidēšanās ar protonu atbrīvošanu; skalārie protoni
Protondzinējspēka veidošanos atvieglo tas, ka protoni tieši iesaistīti daudzās red-oks reakcijās

5. Fea33+- O -– O --Cub2+ Fea33+- O -– O --Cub2+
Brzezinski and Gennis (2008) J Bioenerg Biomembr 40:521–531

6. P Kā tiek pētīti citohroma c oksidāzes elementārie reakcijas etapi?
Stacionārās kinētikas dati nesniedz informāciju par enzimātiskās reakcijas mehanisma elementārajiem soļiem, piemēram, elementārajām konstantēm P
To ļauj priekšstacionārā kinētika, kas aplūko periodu, kurā [ES] nav vēl stabilizējies – no pikosekundēm līdz sekundei

7. matrix e- e- e- e- a a3 O2 O2 O2 CuA O2 CO CuB O2 O2 O2
Lai noskaidrotu elementāros reakcijas etapus, kuru laika mērogs ir mikrosekunžu diapazonā, pielieto flash-fotolīzi, vienu no priekšstacionārās kinētikas metodēm O2 e- O2 O2
CuA e- e- e- O2 CO
CuB a a3 O2 O2 O2
cyt c oksidāzes preparātu anaerobos apstākļos reducē, izgāzē ar CO, kas cieši piesaistās binukleārajā centrā, un tad piesātina vidi ar skābekli
matrix

8. matrix e- e- e- e- a a3 O2 O2 O2 CuA O2 CuB CO O2 O2 O2
Lai noskaidrotu elementāros reakcijas etapus, kuru laika mērogs ir mikrosekunžu diapazonā, pielieto flash-fotolīzi O2 e- O2 O2
CuA e- e- e- O2
CuB a a3 CO O2 O2 O2
Tad ar ≈ 10 nanosekunžu lāzera impulsu (‘flash’) izraisa CO disociāciju no binukleārā centra, kam var sekot pārākumā esošā skābekļa piesaistīšanās
matrix

9. Ballmoos et al. (2011) PNAS vol. 108: 11057–11062
Notikumiem pēc skābekļa piesaistīšanās var izsekot spektroskopiski, ar mikrosekunžu izšķirtspēju:
560 nm – citohroma redox stāvoklis;
610 nm – peroksisavienojuma veidošanās;
570 nm – pH indikators fenolsarkanais, kura absorbcija pieaug, saistot protonu;
830 nm – CuA redox stāvokļa izmaiņas
Ballmoos et al. (2011) PNAS vol. 108: 11057–11062

10. H+ matrix a a3 Kā darbojas protonu sūknis?
Elektronam nonākot hidrofobajā vidē pie binukleārā centra, kur vides dielektriskā konstante ir ļoti zema, tā nekompensētais negatīvais lādiņš rada enerģētiski nestabilu stāvokli
CuA e-
CuB a a3 H+
Vektoriālais H+ elektriski kompensē elektronu
matrix

11. H+ H+ matrix a a3 Kā darbojas protonu sūknis?
Binukleārajā centrā saistoties skalārajam protonam, tas ar savu elektrisko lādiņu sekmē vektoriālā protona disociāciju H+
CuA
CuB a a3 H+
matrix

12. Ne visas vara-hema oksidāzes ir cyt c oksidāzes, un ne visas terminālās oksidāzes pieder vara-hema grupai
piemēram, E. coli terminālās oksidāzes: bo bd
• abas oksidē ubihinolu, nevis cyt. c
Periplazma
2H+
2H+
2H+
• tikai bo pieder vara – hema oksidāžu grupai
2e-
UQH2 UQ b
o Cu
2e-
2e-
UQH2 UQ
b595 d
b558
2H+
• bo pumpē protonus, H+/e-=2
2H++ 0.5O H2O
2H++ 0.5O H2O
Citoplazma
• bd nepumpē protonus, H+/e-=1; protondzinēj-spēku veido tikai skalārie protoni

13. III komplekss, jeb bc1 komplekss, jeb ubihinol:cyt. c oksidoreduktāze
Ciklisks elektronu transports – red-oks reakcijas ar H+ saistīšanu un atbrīvošanu notiek pretējās membrānas pusēs
Ciklam ir 2 apgriezieni:
QH2 pie ārējās virsmas oksidējas par Q, 2H+ tiek atbrīvoti starpmembrānu telpā, 1e- tiek pārnests uz c1 un 1e- caur cit. bl un bh uz Q pie membrānas iekšējās virsmas, to reducējot par QH., protonu piesaistot no matriksa puses
tas pats, tikai pie iekšējās virsmas QH., piesaistot vēl vienu protonu no matriksa puses, reducējas par QH2
matrix

14. matrix
I komplekss (NADH:UQ oksidoreduktāze) ir vislielākais elpošanas ķēdes komplekss
Red-oks kofaktori – FMN, vairāki (7) Fe/S centri (N1a, N1b, N2,...) un kompleksā saistīts ubihinons
H+ translokācijas mehanisms – iespējams, protonu sūknis, kā citohromoksidāzē: red-oks reakcijas pie N2 izsauc konformāciju izmaiņas, kuras darbina H+ vai Na+ sūkni (daļai baktēriju)

15. Elpošanas ķēde ir aktīvo skābekļa formu avots
Elektronu pārnesēju autooksidācija: flavīni semihinons
Vienelektrona skābekļa molekulas reducēšana dod superoksīda anjonradikāli;
divelektronu skābekļa molekulas reducēšana dod ūdeņraža peroksīdu
Četrelektronu skābekļa reducēšanā terminālajā oksidāzē rodas ūdens

16. Oksidatīvo stresu šūnā rada skābekļa aktīvās formas, tām mijiedarbojoties ar brīvu (kofaktoros neiesaistītu) Fe2+
Divvērtīgā dzelzs viegli asociē pie proteīniem un DNS, un iesaistoties Fentona reakcijā izraisa oksidatīvus bojājumus
Fentona reakcija:
Aerobos augšanas apstākļos šie oksidatīvie bojājumi ir galvenais mutaģenēzes avots. Mutanti ar defektīvām DNS reparācijas sistēmām ir hipersensitīvi pret H2O2.

17. [4Fe – 4S]2+ O2.- H2O2 [3Fe – 4S]+ + Fe3+ [3Fe – 4S]2+ + Fe2+ H2O2
Superoksīds un ūdeņraža peroksīds noārda dzelzs-sēra klasterus, kas ir daudzu fermentu prostētiskās grupas:
[4Fe – 4S]2+
O2.-
H2O2
[3Fe – 4S]+ + Fe3+
[3Fe – 4S]2+ + Fe2+
Aizsardzības mehanismi:
šūnā pēc oksidatīvā stresa notiek strauja klasteru reparācija
parādīts, ka oksidatīvā stresa apstākļos Fe-S klasterus saturoši enzīmi (piem. fumarāze un akonitāze Krebsa ciklā) tiek nomainīti pret izoenzīmiem, kas šādus kofaktorus nesatur
H2O2
Fentona reakcija
Fe3+ + HO.

18. Kas pazemina superoksīda un H2O2 līmeni šūnā?
Superoksīddismutāzes reakcija:
2 O H+  O2 + H2O2
Katalāzes reakcija:
Peroksidāžu reakcijas:

19. H2O2 izraisa S-S saišu veidošanos proteīnos.
Tioredoksīni un glutaredoksīni ir nelieli –SH grupas saturoši olbaltumi, kuri veic oksidētu makromolekulu redox reparāciju, reducējot to S-S saites. Glutations ir tripeptīds (Glu-Cys-Gly) ar līdzīgu funkciju
Savu SH grupu reģenerēšanai kā reducējošo ekvivalentu avotu tie izmanto NADPH.
NADPH ir svarīgākais elektronu donors šūnas aizsargsistēmām oksidatīvā stresa apstākļos.

21. H2O2 inhibē GAPDH un novirza katabolismu uz pentozofosfāta ceļu

22. Augos iespējams alternatīvs elektronu transports, kurš neietver I, III un IV kompleksus, un ģenerē siltumu, neveidojot protondzinējspēku
a member of the di-iron carboxylate group of proteins, characterized by an active site that includes two iron atoms coordinated by several highly conserved glutamate and histidine residues