1. quy hoạch thực nghiệm CHIA SẺ KINH NGHIỆM
Tiến trình và phương pháp thí nghiệm
tối ưu hóa môi trường, điều kiện
nuôi cấy/lên men vi sinh vật bằng
quy hoạch thực nghiệm
CHIA SẺ KINH NGHIỆM
Bùi Hồng Quân
Giảng viên Viện CNSH-TP - Đại học Công nghiệp Tp.HCM
Nghiên cứu sinh: Đại học Bách Khoa Tp.HCM

2. Giới thiệu về lên men
Quan điểm của nhà hóa sinh học: lên men là quá trình sản sinh năng lượng. Các hợp chất hữu cơ hoạt động với vai trò vừa là chất cho, vừa là chất nhận điện tử. Lên men là quá trình yếm khí, năng lượng được sản xuất không cần có oxy hoặc các chất nhận điện tử vô cơ khác.
Quan điểm của Pasteur: 1857, “Fermentation is the transformation process of the sugar to alcohol in presence of "la vie sans l'air" (means life without air)
Hiệu quả kinh tế của quá trình lên men phụ thuộc vào chủng siêu tổng hợp và điều kiện nuôi cấy tối ưu.Môi trường nuôi cấy đặc biệt quan trọng vì nó ảnh hưởng đến quá trình thu hoạch sau lên men. Dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy liên quan đến trao đổi chất của tế bào, sự phát triển của vi sinh vật và sự tạo thành sản phẩm.
Theo nghĩa mở rộng: lên men là quá trình nuôi cấy VSV (có oxy hoặc không có oxy) để thu nhận sinh khối, các sản phẩm trao đổi chất, thực hiện sự chuyển hóa cơ chất.

3. Tối ưu hóa trong lên men
Tối ưu hóa quá trình chuyển hóa: Sử dụng kỹ thuật di truyền  giống vsv mới
Hiệu quả kinh tế của quá trình lên men phụ thuộc vào chủng siêu tổng hợp và điều kiện nuôi cấy tối ưu.Môi trường nuôi cấy đặc biệt quan trọng vì nó ảnh hưởng đến quá trình thu hoạch sau lên men. Dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy liên quan đến trao đổi chất của tế bào, sự phát triển của vi sinh vật và sự tạo thành sản phẩm.

4. Tối ưu hóa trong lên men
Tối ưu hóa quá trình lên men:
Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy (100ml)
Tối ưu hóa quá trình lên men theo mẻ
Tối ưu hóa quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất
Tối ưu hóa quá trình lên men liên tục
Hiệu quả kinh tế của quá trình lên men phụ thuộc vào chủng siêu tổng hợp và điều kiện nuôi cấy tối ưu.Môi trường nuôi cấy đặc biệt quan trọng vì nó ảnh hưởng đến quá trình thu hoạch sau lên men. Dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy liên quan đến trao đổi chất của tế bào, sự phát triển của vi sinh vật và sự tạo thành sản phẩm.

5. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường tổng hợp: meat, casein, đnành, YE*.
Môi trường bán tổng hợp (trong công nghiệp lên men, đặc biệt, không công bố)
Ảnh hưởng
Sự chuyển hóa
Sự phát triển của tế bào
Sự hình thành sản phẩm  quá trình thu hoạch
Hiệu quả kinh tế của quá trình lên men phụ thuộc vào chủng siêu tổng hợp và điều kiện nuôi cấy tối ưu.Môi trường nuôi cấy đặc biệt quan trọng vì nó ảnh hưởng đến quá trình thu hoạch sau lên men. Dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy liên quan đến trao đổi chất của tế bào, sự phát triển của vi sinh vật và sự tạo thành sản phẩm.

6. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
Tham khảo các môi trường đã được công bố
(Selection)
Tiền sàng lọc và sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng (Screening)
Thu hẹp vùng ảnh hưởng của yếu tố (Narowing)
Tìm mô hình tối ưu hóa
(Optimization)
Đánh giá mô hình tối ưu trong thực nghiệm (Validation)

7. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
Tham khảo các môi trường đã được công bố.
Tạp chí
Sách
Kinh nghiệm
Trao đổi

8. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
Phù hợp cho tiền sàng lọc.
Số thí nghiệm lớn nếu tính đến sự tương tác của các yếu tố.
Phương pháp thực nghiệm 1 nhân tố
Tiền sàng lọc

9. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
Ưu điểm
N+1
PT đường thẳng
Plackett - Burman
2n thí nghiệm
Pt đường thẳng
FFD
Sàng lọc

10. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
Dòng đầu tiên/ Cột đầu tiên được cho bởi: Plackett RL, Burman JP (1946) The design of optimum multifactorial experiments. Biometrika 37:305–25.
Các dòng tiếp theo được thành lập bằng cách lấy dòng trước liền kề từ vị trí 1 đến vị trí n-1 để thành vị trí thứ 2 đến n của dòng tiếp theo.
11:06:55 PM

11. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
11:06:55 PM

12. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
Nguyên lý
Lưu ý
Thực hiện
Xử lý
Phương pháp đường dốc nhất (Steepest Descent method)
Thu hẹp

13. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
Quay bậc 2
Box Wilson
Box - Behnken
RSM-CCD
RSM là công cụ tiêu chuẩn để phát triển môi trường nuôi cấy
Tối ưu hóa

14. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

15. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

16. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

17. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

18. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Bacillus subtilis

19. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Bacillus subtilis

20. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Bacillus subtilis

21. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Bacillus subtilis

22. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Bacillus subtilis

23. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Bacillus megatherium

24. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Bacillus megatherium

25. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Bacillus megatherium

26. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Bacillus megatherium

27. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Nitrosomonas marina

28. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Nitrobacter winogradskyi

29. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Nitrosomonas marina

30. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Nitrosomonas marina

31. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Nitrobacter winogradskyi

32. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Nitrobacter winogradskyi

33. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Ví dụ Nitrobacter winogradskyi

34. 325 23
Tối ưu hóa khả năng phân giải lân Ví dụ Chủng trực khuẩn gram âm S4b
Mục đích chính của việc thực hiện ma trận P-B là nhằm sàng lọc ra các yếu tố ảnh hưởng nhất đến khả năng hoà tan của chủng S4b.
Qua các tài liệu tham khảo, 11 yếu tố được đưa ra như ở bảng 3.1, với mỗi yếu tố được khảo sát ở 2 mức cao và thấp.

35. 43 36
Tối ưu hóa khả năng phân giải lân Ví dụ Chủng trực khuẩn gram âm S4b
Với 11 yếu tố, 12 thí nghiệm được bố trí theo ma trận P-B. Dấu + biểu hiện mức cao, ‒ mức thấp.
Kết quả xác định hàm lượng phosphate của 12 thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.5, trong đó giá trị hàm lượng phosphate nằm trong khoảng…

36. 326 26
44 38
Tối ưu hóa khả năng phân giải lân Ví dụ Chủng trực khuẩn gram âm S4b
Path of steppest ascent
Yếu tố
Hàm lượng PO43- (mg/l) x2 x4
x11
Mức ảnh hưởng (bi)
-1,177
0,50
0,813
Khoảng biến thiên (Δi)
-1,250
0,10
1,000
Bước chuyển động
1,35
0,05
0,500
Thí nghiệm 1
7,50
0,30
3,000
9,97
Thí nghiệm 2
6,15
0,35
3,500
11,63
Thí nghiệm 3
4,80
0,40
4,000
12,40
Thí nghiệm 4
3,45
0,45
4,500
15,04
Thí nghiệm 5
2,10
5,000
14,07
Thí nghiệm 6
0,75
0,55
5,500
11,22
x2 - Ca3(PO4)2 ; x4 - (NH4)2SO4 ; x11 - Tỉ lệ giống
Mục đích
Xác định bước chuyển động được thực hiện theo như trên bảng, 6 thí nghiệm được đưa ra như ở bảng 3.3.

37. 327 27
Tối ưu hóa khả năng phân giải lân Ví dụ Chủng trực khuẩn gram âm S4b
Yếu tố
Mức
(-α)
(-1)
(0)
(+1)
(+α) x2
Ca3(PO4)2
(g/l)
1,18
2,1
3,45
4,8
5,72 x4
(NH4)2SO4
0,37
0,4
0,45
0,5
0,53
x11
Tỉ lệ giống
(%)
3,70
4,0
4,50
5,0
5,30
Sau khi sàng lọc bằng ma trận P-B và xác định khoảng tối ưu bằng phương pháp TUHTN ĐDN, 3 yếu tố ảnh hưởng nhất được khảo sát ở 5 mức

38. Tối ưu hóa khả năng phân giải lân Ví dụ Chủng trực khuẩn gram âm S4b
20 thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp RSM-CCD ở các giá trị khsát khác nhau, trong đó 6 thí nghiệm cuối được thực hiện ở mức trung tâm.

39. Mặt đáp ứng nồng độ phosphate hoà tan theo Ca3(PO4)2 và (NH4)2SO4
Tối ưu hóa khả năng phân giải lân Ví dụ Chủng trực khuẩn gram âm S4b
Y (mg/l) = – 22,25 – 1,9x ,07x4 + 2,34x11 + 0,34x22 – 144,76x42
Nồng độ (PO4)3- hoà tan
(NH4)2SO4
Ca3(PO4)2
Mặt đáp ứng nồng độ phosphate hoà tan theo Ca3(PO4)2 và (NH4)2SO4

40. Mặt đáp ứng nồng độ phosphate hoà tan theo (NH4)2SO4 và tỉ lệ giống
Tối ưu hóa khả năng phân giải lân Ví dụ Chủng trực khuẩn gram âm S4b
Y (mg/l) = – 22,25 – 1,9x ,07x4 + 2,34x11 + 0,34x22 – 144,76x42
Nồng độ (PO4)3- hoà tan
(NH4)2SO4
Tỉ lệ giống
Mặt đáp ứng nồng độ phosphate hoà tan theo (NH4)2SO4 và tỉ lệ giống

41. Bảng. Giải pháp đề xuất thực hiện theo RSM – CCD41
Tối ưu hóa khả năng phân giải lân Ví dụ Chủng trực khuẩn gram âm S4b
Bảng. Giải pháp đề xuất thực hiện theo RSM – CCD
Giải pháp
Yếu tố
Hàm lượng PO43- (mg/l)
x2 - Ca3(PO4)2
x4 - (NH4)2SO4
x11 - Tỉ lệ giống 01
4,8
0,48
5,00
21,0141 15
4,88
20,7441
Trong 23 giải pháp mà chương trình đưa ra, giải pháp 15 được chọn.

42. Thông tin liên hệ www.buihongquan.tk
Di động:

43. Cảm ơn quý vị đã chú ý lắng nghe!43