1. (VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI)
VIRUSOLOĢIJA
(VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI)
PĒTĪŠANAS METODES

2. IMUNOLOĢISKĀS METODES
Vispārīgs priekšstats par imūnās aizsardzības sistēmu un imūnās atbildes veidošanos

3. Paul Ehrich Илья Мечников
IMUNOLOĢIJAS PAMATLICĒJI
Paul Ehrich Илья Мечников
( ) ( )
Humorālā un šūnu imunitāte, imunoloģijas sākums NP g.

4. Jules Bordet (1870.-1961.) Antivielas, komplements NP - 1919.g.
IMUNOLOĢIJAS PAMATLICĒJI
Jules Bordet ( ) Antivielas, komplements NP g.

5. Galvenie imūnās sistēmas orgāni:
Sarkanās kaulu smadzenes (mieloīdā sistēma)
Liesa
Tīmuss
Limfmezgli:
embrionālie (germinālie) centri
(limfoīdā sistēma)
Galvenās imūnās šūnas:
Retikuloendoteliālās sistēmas šūnas
(PMNC, mononukleārie fagocīti)
Limfocīti

7. (spēja atšķirt savējo no sveša, svešo iznīcināt)
Organisma imunitāte
(spēja atšķirt savējo no sveša, svešo iznīcināt)
Nespecifiskā imunitāte
Specifiskā imunitāte
Komplements, interferons
Fagocitoze
Šūnu imunitāte
Humorālā (seruma) imunitāte

8. Nespecifiskās imunitāte Nespecifiskās rezistences mehānismipH
Lizocīms u.c. enzīmi
Komplements
Interferons
1. Fiziskās barjeras
2. Bioķīmiskās barjeras
3. Bioloģiskās barjeras
Akūtās fāzes
reakcija;
Fagocitoze,
Mikroflora

9. Vīrusu inficētie leikocīti izstrādā speciālu nelielu (~20 kD) olbaltumvielu,
INTERFERONU, maisījumu, kas padara citas šūnas neuzņēmīgas pret vīrusu uzbrukumu

10. IFN-α gēniem nav intronu
Dzīvnieku šūnu producētie interferona proteīni ir glikozilēti

11. Komplements
Ap 20 asins plazmas proteīnu komplekss (5% asins plazmas proteīnu masas), kas aktivētā veidā izraisa dažādu šūnu lizēšanu

13. Iekaisuma (akūtās fāzes) reakcija
Komplementa aktivēšana izraisa arī neitrofīlu migrēšanu un infekcijas vietu

14. Iekaisuma (akūtās fāzes) reakcija

15. Fagocitoze
Opsonizācija: baktēriju un citu šūnu fagocitozes veicināšana, pīesaistot to virsmai asins seruma proteīnus vai citas makromolekulas, piem.: polisaharīdus

16. FAGOCITOZES PROCESS

17. Oksidatīvais (elpošanas) sprādziens
FAGOCITOZES POSMI
Baktēriju piesaistīšanās pie membrānu pseidopodijām
Baktēriju ieslēgšana fagosomā
Fagosomas un lizosomas saplūšana
Baktēriju noārdīšana
Atkritumu izvadīšana
Oksidatīvais (elpošanas) sprādziens

18. Oksidatīvais (elpošanas) sprādziens
TNF (audzēju nekrozes faktora) un fMLPR ( formilpeptīdu) recoptori dod signālu fagocītiskās oksidāzes (Phox, NADPH oksidāzes) kompleksam, kas veido aktīvā skābekļa (O2-) jonus

19. (spēja atšķirt savējo no sveša, svešo iznīcināt)
Organisma imunitāte
(spēja atšķirt savējo no sveša, svešo iznīcināt)
Nespecifiskā imunitāte
Specifiskā imunitāte
Komplements
Fagocitoze
Šūnu imunitāte
Humorālā (seruma) imunitāte

21. Humorālā imunitāte
Imunoglobulīnu relatīvais izmērs

22. Humorālā imunitāte
ANTIVIELAS
Imunoglobulīnu
struktūra

23. Humorālā imunitāte
ANTIVIELAS
Imunoglobulīnu
struktūra (IgG)

24. Humorālā imunitāte
ANTIVIELAS
Imunoglobulīni

25. Antigēna un antivielas mijiedarbība šķīdumā
Humorālā imunitāte
Antigēna un antivielas mijiedarbība šķīdumā
ANTIGĒNS
Antigēni - proteīni, polosaharīdi, nukleīnskābes, to kompleksi. Imunogenitāte

26. Humorālā imunitāte HAPTĒNS
Neliela molekula, kas spēj izraisīt antivielu veidošanos tad, ja piesaistīta polimērai struktūrai
Digitoksigenīns

27. IMUNOLOĢIJAS KLASIĶI
                               
Frenks M. Burne ( ) Imūnā tolerance, antivielu producējošo šūnu klonālās selekcijas teorija NP g.
Nils Jerne ( ) Antivielu producējošo šūnu klonālās selekcijas teorija NP g.

28. KLONĀLĀS SELEKCIJAS TEORIJA
Lai veidotos specifiskā imūnā atbilde, antigēnu (Ag) jāatpazīst.
Ag atpazīšana notiek tam saistoties ar īpašiem receptoriem.
Ag atpazīšana ir saistīta ar starpšūnu mijiedarbību.
Starpšūnu mijiedarbību kontrolē saistīšanās ar MHC (Major Histocompatibility Complex) proteīniem -receptoriem

29. KLONĀLĀS SELEKCIJAS TEORIJA
Katrs B limfocīts nes unikālu antigēna (Ag) receptoru
Saskarsme ar molekulu, kura spēj stingri saistīt receptoru izraisa attiecīgā limfocīta aktivāciju
Diferencētās efektoršūnas, kuras rodas no aktivētā limfocīta, nes tādus pašus receptorus, kā sākotnējais limfocīts.
Limfocīti, kuri nes receptorus pret paša organisma molekulām, tiek iznīcināti agrīnās attīstības stadijās

30. Humorālā imunitāte: klonālās selekcijas teorija
Katrs limfocīts nes unikālu receptoru: antivielas priekšteci, kas radies imunoglobulīnu gēnu rekombinācijas un splaisinga rezultātā.
Iespējamas pavisam 7500 (150 V gēni x 5 J gēni un ap 10 variantu kā savienot V un J) imunoglobulīnu vieglās ķēdes variantu; 2,4 miljonu (80 V gēni x 50 D gēni x 6 J gēni un ap 100 savienošanas versiju) smagās ķēdes variantu.
Antivielu iespējamā daudzveidība: x ~ 18 miljardi variantu

31. Humorālā imunitāte: klonālās selekcijas teorija

32. Humorālā imunitāte
ANTIGĒNA
PREZENTĀCIJA
MHC II
struktūra

33. Humorālā imunitāte

35. Humorālā imunitāte

36. Humorālā imunitāte
ANTIVIELAS
Imunoglobulīnu
tipi

37. Humorālās imunitātes veidošanās

38. Humorālās imunitātes veidošanās
Adjuvanti:
vielas, kas pastiprina antivielu veidošanos pret citiem antigēniem
Freinda adjuvants:
BCG (Bacillus Calmet - Gerain)
Lanolīneļla

40. Antivielu veidotos imūnos kompleksus jāiznīcina
Komplementa aktivācijas klasiskais ceļš: kompleksa proteīni izveido kanālus ar imunoglobulīniem (antivielām) iezīmētu šūnu apvalkos / membrānās. Šūnas iet bojā.

41. Komplements

42. Komplements

43. Antigēnu un antivielu mijiedarbība
Precipitācija

44. Antigēnu un antivielu mijiedarbība
Precipitācija

45. Antigēnu un antivielu mijiedarbība
Precipitācija

46. Antigēnu un antivielu mijiedarbība
Precipitācija

47. Antigēnu un antivielu mijiedarbība
Precipitācija
Dubultā radiālā imunodifūzija pēc Ohterlouni

48. Antigēnu un antivielu mijiedarbība
Precipitācija
Dubultā radiālā imunodifūzija pēc Ohterlouni

49. Antigēnu un antivielu mijiedarbība
Precipitācija
Dubultā radiālā imunodifūzija pēc Ohterlouni

50. Vīrusu un antivielu mijiedarbība
Neitralizācija

51. Antigēnu un antivielu mijiedarbība
Aglutinācija

52. Vīrusu un eritrocītu mijiedarbība
Hemaglutinācija

53. Vīrusu un eritrocītu mijiedarbība
Hemaglutinācija

54. Vīrusu un eritrocītu mijiedarbība antivielu klātbūtnē
Hemaglutinācijas inhibīcija

55. Vīrusu un eritrocītu mijiedarbība
Hemadsorbcija

56. Komplementa atkarīgas hemolīzes reakcijas
Hemolīzes sistēma = eritrocīti + specifiski Ag

57. Komplementa atkarīgas hemolīzes reakcijas

58. Vīrusu un modificētu antivielu mijiedarbība
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzyme immuno assay (EIA)
Imobilizēti reakcijas komponenti
Vairākkārtīgas mijiedarbības (desmaizes princips)
Modificētas (konjugētas) antivielas

59. Avidīna (streptavidīna, neiravidīna) / biotīna mijiedarbība
Biotīns (vitamīns H) Avidīns (proteīns) ar 4 biotīna saistības vietām
Signāla amplifikācija biotīna/avidīna mijiedarbībā

60. Avidīna / biotīna mijiedarbība

61. Vīrusu un modificētu antivielu mijiedarbība
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzyme immuno assay (EIA)
E - sārmainā fosfatāze
S - p-nitrofenilfosfāts

62. Vīrusu un modificētu antivielu mijiedarbība
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzyme immuno assay (EIA)
E - sārmainā fosfatāze
S - p-nitrofenilfosfāts

63. Vīrusu un modificētu antivielu mijiedarbība
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Enzyme immuno assay (EIA)
E - sārmainā fosfatāze
S - p-nitrofenilfosfāts

64. Vīrusu un modificētu antivielu mijiedarbība Radio-immuno assay (RIA)

65. Vīrusu un modificētu antivielu mijiedarbība
Imūncitoķīmija un imūnhistoķīmija
Tiešā un netiešā imunofluorescence
Staphylococcus aureus A proteīns

66. Laterālās kapilārās plūsmas metode
(ELISA modifikācija indikatorpapīru veidā)

67. Pārtikas vīrusu identificēšana inficētajā personā
Rotavīrusu un adenovīrusu antigēns 5,26 EUR
Norovīrusa antigēns 8,58 EUR
© Centrālā laboratorija SIA
© E. Gulbja laboratorija SIA

68. Histoloģija un imūnhistoķīmija
Histopathologic changes associated with rabies encephalitis by Hematoxilline&Eosine stain. Negri bodies are cellular inclusions found in the pyramidal cells of Ammon's horn, and the Purkinje cells of the cerebellum.
A rabies-infected neuronal cell with intracytoplasmic inclusions. The red stain indicates areas of rabies viral antigen by using IHC or avidin-biotin complex technique.

69. Imūncitoķīmija un imūnhistoķīmija Tiešā un netiešā imunofluorescence
BK vīrusa imūncitoķīmiska krāsošana hemorāģiska cistīta pacienta urīna šūnās
Zairas Ebolas vīrusa antigēna imūncitoķīmiska krāsošana inficētas cūkas plaušu šūnās

70. Vīrusu proteīnu un modificētu antivielu mijiedarbība
Western blot
1. Elektropārnese uz membrānu filtra
2. Bloķēšanas reakcija
3. Apstrāde ar vīrusspecifiskām antivielām
4. Apstrāde ar konjugētām, sugasspecifiskām antivielām
5. Attīstīšana

71. Vīrusu nukleīnskābju un modificētu antivielu mijiedarbība
Hibrīda saistīšana

72. Vīrusu nukleīnskābju un modificētu antivielu mijiedarbība
Hibrīda saistīšana

73. (spēja atšķirt savējo no sveša, svešo iznīcināt)
Organisma imunitāte
(spēja atšķirt savējo no sveša, svešo iznīcināt)
Nespecifiskā imunitāte
Specifiskā imunitāte
Šūnu imunitāte
Humorālā (seruma) imunitāte

74. IMUNOLOĢIJAS KLASIĶI
Peter Doherty (1940.) Rolf Zinkernagel (1944.) Šūnu imunitātes mehānisms g., NP g.

75. Šūnu imunitāte

76. Šūnu imunitāte
ANTIGĒNA
PREZENTĀCIJA
MHC I
struktūra

77. IZŠĶIROŠAIS EKSPERIMENTS

78. Peļu līnija “B”; Vīruss “X”; reakcijas nav
No peles izolē T-citotoksiskās šūnas un audzē tās kopā ar dažādu vīrusu inficētām šūnām no dažādām peļu līnijām
Peļu līnija “B”; Vīruss “X”; reakcijas nav

79. Peļu līnija “A”; Vīruss “Y”; reakcijas nav
No peles izolē T-citotoksiskās šūnas un audzē tās kopā ar dažādu vīrusu inficētām šūnām no dažādām peļu līnijām
Peļu līnija “A”; Vīruss “Y”; reakcijas nav

80. Peļu līnija “A”; Vīruss “X”; reakcija ir
No peles izolē T-citotoksiskās šūnas un audzē tās kopā ar dažādu vīrusu inficētām šūnām no dažādām peļu līnijām
Peļu līnija “A”; Vīruss “X”; reakcija ir

82. Apkopojot: imūno atbildi veidojošo šūnu funkcijas

83. Apkopojot: imūnā atbilde uz dažādiem patogēniem

84. IMUNOLOĢIJAS KLASIĶI
Cesar Milstein (1927.) Georges Koehler ( )
Monoklonālo antivielu iegūšanas metode g., NP g.

85. Monoklonālu antivielu iegūšana
1976.,
Koehler G., Milstein C.
Limfocītu un mielomas šūnu hibrīdi producē Av, kas ir specifiskas vienam epitopam

86. Monoklonālas antivielas veidojošu hibridomu iegūšana
HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) barotne; TK un HGPRT pozitīvas šūnas
Aminopterīns

87. Fluorescence activated (assisted) cell sorting
Monoklonālu antivielu izmantošana šūnu diferencēšanās pazīmju noteikšanai
FACS -
Fluorescence activated (assisted) cell sorting

88. FACS tehnoloģija

89. FACS tehnoloģija

90. FACS tehnoloģijas izmantošana
Saskaitīt daļiņas suspensijā
Noteikt bioloģisku materiālu no nebioloģiska
Atdalīt/noteikt “dzīvās” un “nedzīvās” daļiņas
Izvērtēt no daļiņas vienā minūtē
Sortēt atsevišķas daļiņas turpmākām analīzēm

91. FACS tehnoloģijas attīstība: pirmie aparāti

92. FACS tehnoloģijas attīstība: modernie aparāti

93. Luminex tehnoloģija
5,6 mm diametra lodītes (mikrosfēras) iekrāso 100 atšķirīgos toņos (10 unikālas sarkanās x 10 unikālas infrasarkanās krāsas koncentrācijas). Katru iekrāsoto mikrosfēru grupu pārklāj ar sava veida antivielām. Analizatorā ar lāzeriem identificē katru mikrosfēru grupu un, ja antiviela piesaistījusi antigēnu, tad arī papildus piesaistīto sekundāro krāsvielu. Katras mikrosfēru grupas mērījumus vairākkārtīgi atkārto, vienā paraugā iespējams vienlaikus, ātri un precīzi kvantitatīvi identificēt līdz 100 dažādus proteīnus.

94. Luminex tehnoloģija http://www.panomics.com/index.php?id=product_96