1. الطريقة المستمرة لتقدير فعالية انزيم البيروكسيديز Peroxidase
Third class
Lab no.1
Enzymology
Teacher zainab salim

2. نوع الانزيم واستخداماته
وهو من انزيمات الاكسدة والاختزال Oxidoreductases المنتشرة في الطبيعة بشكل واسع .
له استخدامات متعددة اذ يدخل في تركيب العدد التشخيصية الخاصة بتقدير الكلوكوز مشاركة مع انزيم الكلوكوز اوكسيديز .
له اهمية في تقنية الاليزا ELISA المهمه في التفاعلات المناعية وغيرها .
يدخل في علاج الامراض الجلدية .

3. Enzymes

4. Enzyme Reactions
ENZYME
SUBSTRATE
PRODUCT

5. مصادر الانزيم
المصدر الرئيس لانتاج الانزيم هو النباتات كالفجل والرشاد والالمازه وغيرها . اذ يعد الانزيم احد المراكز الدفاعية في النبات , ويوجد في الاحياء المجهرية والحليب .
المادة الاساس التي يعمل عليها الانزيم هي بيروكسيد الهيدروجين H2O2 اذ يعمل على تحليلها الى اوكسجين وماء .
ولتقدير فعالية الانزيم تستخدم طرق لونية تستعمل فيها مواد تعرف بانها مستقبلة للاوكسجين (O2 Acceptor ) كمادة الكواياكول (Guiacol ) وهي مادة عديمة اللون عند اضافتها الى وسط التفاعل الانزيمي تعمل على الاتحاد مع الاوكسجين المتحرر من التفاعل ليتكون معقد بني اللون هو التتراكواياكول (Tetraguiacol ) الذي يمتلك طيف موجي اعظم على طول موجي نانومتر.

6. المواد والكواشف 1- الكواياكول 0.1% H2O2 0.15%
M Ph = 7 Buffer phosphate 0.1
انزيم البيروكسيديز

7. طريقة العمل - تمزج حجوم متساوية (1)مل من كل من:
الكواياكول ,وبيروكسيد الهيدروجين ,وبفر الفوسفات .
ثم يضاف (7) مل من الماء المقطر ليصبح الحجم (10)مل .
ياخذ منها (3) مل لتوضع في في جهاز (Spectrophotometer ) لتصفير الجهاز على طول موجي 436 نانومتر ويعتبر هذا الوقت هو زمن الصفر لعدم وجود انزيم .
بعد ذلك يتم اضافة 0.1 مل من الانزيم الى خلية الجهاز ويتم مزجها بحذر .
يبدء حساب الوقت لتاخذ القراءات في الجهاز كل نصف دقيق او دقيقة واحدة لحين استقرار قراءة الجهاز .

8. Measuring color change with spectrophotometer – measures the amount of light that penetrates at different wavelengths

10. الحسابات تمثل القيم بيانياً بين الامتصاصية والزمن لنحصل على
علاقة خطية كما في الرسم :
علاقة خطية :
نستخرج قيمة الميل Slope
كما يلي:
Δ A = slope الامتصاصية
Δ T
Δ T = التغير في الزمن
= Δ A التغير في الامتصاصية
الزمن

11. ولاستخراج فعالية انزيم البيروكسيديز نطبق القانون التالي :
الفعالية (Unit/ml ) = الميل × الحجم الكلي في خلية الجهاز 3.1
حجم الانزيم × طول المسار الضوئي × ثابت النفوذية المولارية

12. الملاحظات 0.1× 1× 6.4 1- طول المسار الضوئي لخلية الجهاز : 1 سم
2- ثابت النفاذية المولارية للكواياكول: 6.4
-3 بناءا على المعطيات في النقطتين الاولى والثانية سيطبق قانون الفعالية كالاتي :
الفعالية (Unit/ml ) = الميل × × 1000
0.1× 1× 6.4
4- لكل انزيم تعريف خاص بالفعالية او بوحدة الفعالية يمكن من خلاله صياغة قانون الفعالية لذلك الانزيم .
5- لذا يمكن ان نعرف وحدة الفعالية لانزيم البيروكسيديز بأنها كمية الانزيم اللازمه لتحويل مايكرومولار واحد من بيروكسيد الهيدروجين H2O2 الى ناتج في دقيقه واحده تحت ظروف التفاعل .