1. Ievads proteīnu kristalogrāfijā
(proteīnu rentgenstruktūranalīzē)
Kristalogrāfija vai rentgenstruktūranalīze - metode vielas molekulu trīsdimensionālās struktūras noteikšanai, izmantojot rentgenstaru difrakciju vielas kristālos

2. 2014. – starptautiskais kristalogrāfijas gads

3. Kristalogrāfijas vēsture: ideja
1912. gadā Maksim fon Lauē un Pēterim Paulam Ēvaldam vēsturiskā sarunā Angļu dārzā Minhenē radās ideja apstarot kristālus ar rentgenstariem
1913. gadā tika iegūts pirmais difrakcijas attēls no vara sulfāta kristāla, par ko Lauē gadā saņēma Nobela prēmiju

4. Kristalogrāfijas vēsture: pirmā struktūra
1913. gadā Viljams Lorenss Bregs no difrakcijas datiem izskaitļoja NaCl struktūru, par to gadā saņēma Nobela prēmiju kopā ar savu tēvu Viljamu Henriju Bregu

5. Kristalogrāfijas vēsture: pirmā proteīna struktūra
1958. gadā tika noteikta pirmo proteīnu – mioglobīna un hemoglobīna struktūras, par ko gadā Nobela prēmiju saņēma Makss Perutzs un Džons Kendrjū

6. Kāpēc nepieciešams noteikt proteīnu struktūras?
Vizuāls attēls – kā proteīns izskatās
Priekšstats par to, kā proteīns veic savas funkcijas
Nobela prēmijas...

7. Nobela prēmijas proteīnu kristalogrāfijā
M. F. Perutz, Sir J. C. Kendrew (Chemistry, 1962) for structure of globines
Sir A. Klug (Chemistry, 1982) for his development of crystallographic electron microscopy and his structural elucidation of biologically important nuclei acid-protein complexes
J. Deisenhofer, R. Huber, H. Michel (Chemistry, 1988) for the determination of the three-dimensional structure of a photosynthetic reaction centre
P. D. Boyer, J. E. Walker, J. C. Skou (Chemistry, 1997) for their elucidation of the enzymatic mechanism underlying the synthesis of adenosine triphosphate (ATP) and for the first discovery of an ion-transporting enzyme, Na+, K+ -ATPase
R. D. Kornberg (Chemistry, 2006) for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcription
V. Ramakrishnan, T. A. Steitz, Ada E. Yonath (Chemistry, 2009) for studies of the structure and function of the ribosome
Robert J. Lefkowitz and Brian K. Kobilka (Chemistry, 2012) for studies of G-protein-coupled receptors"

8. Pielietojuma piemērs: jaunu zāļu radīšana
Ar kristalogrāfijas palīdzību var noteikt proteīnu struktūras
Zinot proteīna aktīvā centra struktūru, var prognozēt, kādi savienojumi tur varētu piesaistīties
Labs piemērs – Indinavir (Merck), viens no pirmajiem preparātiem, kuru radīšanā tika pielietota proteīnu kristalogrāfija
HIV proteāze
Aktīvais centrs

9. Kādas manipulācijas jāveic, lai noteiktu proteīnu struktūru
1. – proteīna gēna klonēšana (parasti baktērijās)
2. – proteīna producēšana
3. – proteīna attīrīšana
4. – proteīna kristalizēšana
5. – datu vākšana no kristāliem
6. – struktūras noteikšana
7. – struktūras validēšana un deponēšana PDB datu bankā
8. – struktūras publicēšana

11. Kas ir kristāls ?
Trīsdimensionāls identisku vienības šūnu režģis, kuras ir izvietotas vienā noteiktā orientācijā
Katra vienības šūna var saturēt vienu vai vairākas molekulas

12. Kristāls Kristāls Vienības šūna Molekula
Šajā gadījumā katrā vienības šūnā ir viena molekula un visas vienības šūnas ir taisnstūru paralēlskaldņi

13. Molekula
Vienības šūna
Kristāls
Divas molekulas vienības šūnā, kuras malu leņķi nav 90o

14. Kā iegūt kristālu?
Vienkārši no neorganiskajām un mazām organiskajām molekulām
Grūti no proteīniem
Kāpēc?
-nav termostabili
-var izmantot tikai uz ūdeni bāzētus šķīdumus
-lielas un fleksiblas molekulas
-parasti pieejami ļoti nelielos daudzumos

15. Kā iegūt proteīnu kristālu ?
Princips: lēni paaugstināt precipitantu koncentrāciju šķīdumā
Precipitanti: dažādi sāļi, polietilēnglikoli (PEG), alkoholi
pH buferējošās vielas uztur noteiktu pH – piemēram, acetāta vai tris buferšķīdumi
Aditīvi: vielas, kas nav precipitanti, bet mijiedarbojas ar proteīnu un palīdz tos sakristalizēt (piemēram metālu joni)
Variējamie parametri:
-precipitantu un aditīvu sastāvs
-precipitantu un aditīvu koncentrācija
-proteīna koncentrācija (parasti ap 1%)
-pH
-temperatūra (parasti RT, dažreiz +4, +15 vai +37)
Parasti nav iespējams teorētiski noteikt, kādi precipitanti un kādās koncentrācijās varētu būt nepieciešami, lai veidotos kristāli
Parasti nepieciešams testēt vairākus simtus dažādu apstākļu

16. Fāzes diagramma [proteīns] nogulsnes kristāli? tīrs šķīdums
[precipitants]

17. Sēdošā piliena iztvaikošanas tehnika
Precipitants + proteīns (1:1)
Precipitants
Iztvaikošanas rezultātā lēnām samazinās piliena tilpums un paaugstinās precipitanta un proteīna koncentrācija

18. Kristalizācijas robots
Var viegli pārbaudīt simtiem apstākļu
Var operēt ar ļoti maziem tilpumiem –līdz 0.1 ml

19. Piekārtā piliena iztvaikošanas tehnika
Precipitants + proteīns (1:1)
Iztvaikošana
Precipitants
Princips līdzīgs, kā sēdošajam pilienam, tikai piliens ir «piekārts» pie trauciņa vāka

20. Olu baltuma lizocīma kristalizēšana ar piekārtā piliena tehnoloģiju
Lizocīms ir ļoti viegli kristalizējams proteīns
Kristālus var iegūt dažu minūšu laikā
Mēs izmantosim piekārtā piliena tehnoloģijas atvieglotu variantu – bez precipitanta trauciņa apakšā
Lizocīmu sajauksim ar precipitantu un pilienam ļausim lekcijas turpinājumā lēnām iztvaikot
Pēc lekcijas beigām aplūkosim kristālus mikroskopā un pārbaudīsim to difrakcijas kvalitāti

21. Mini lab. darba protokols
Uz stikla plāksnītes sajaucam pilienu no 5 ml lizocīma šķiduma (40 mg/ml) un 5ml precipitanta (30% w/v metilpolietilēnglikols 5,000, 1.0 M NaCl, 50 mM Na acetāts pH 4.5, 5% glicerīns)
Plāksnīti nosedz ar Petri plates vāciņu
Pēc lekcijas beigām pilienus aplūko mikroskopā
Vienu no iegūtajiem kristāliem ar cilpas palīdzību izņem no šķīduma un ievieto krioplūsmā rentgenstaru difrakcijas aparātā
Darba vadītājs demonstrē difrakcijas attēlu iegūšanu no kristāla

22. Kāpēc nepieciešami tieši rentgensari?
Viļņa garumam ir aptuveni tāds pats izmērs, kā attālums starp atomiem molekulās

23. Kā iegūt rentgenstarus?
Sinhrotrons
Rotējošais anods
Daļiņu paātrinātājs
Lielā ātrumā mainot kustības virzienu, elementārdaļiņas (elektroni vai pozitroni) emitē rentgenstarus
Elektronu kūlis no katoda atsitas pret metāla (parasti Cu) anodu un producē rentgenstarus
X-rays
Copper anode

24. Rotējošais anods Sinhrotrons
Labi:
-Relatīvi lēti (1/2 milj. $)
-Relatīvi mazi
Slikti:
-Radiācija ir vāja
-Viļņa garums ir fiksēts
Labi:
-Radiācija ir spēcīga
-Viļņa garums ir maināms
Slikti:
-Ļoti dārgi (miljardi $)
-Ļoti lieli

25. ESRF sinhrotrons Grenoblē, Francijā
Visspēcīgākais rentgenstaru avots Eiropā
Akadēmiskiem pētījumiem bezmaksas

26. Elektromagnētiskie viļņi
E = A cos wt
w = 2pn
E = A cos (a+wt)
a = 2pZ/l
E- elektromagnētiskā lauka stiprums
A- amplitūda
w- leņķiskais ātrums
n- frekvence
l – viļņa garums
a - fāze

27. Vilnis kā vektors F=Acosa+iAsina vai F=exp(ia) Imaginārā ass A
A- viļņa amplitūda
a- viļņa fāze a
Reālā ass
F=Acosa+iAsina vai
F=exp(ia)

28. Viļņu interference + = + . =

29. Kas notiek ar elektronu, kad pa to trāpa rentgenstari?
Elektrons sāk vibrēt ar tādu pašu frekvenci, ka krītošie rentgenstari
Rezultātā, elektrons izstaro sekundāros rentgenstarus visos virzienos
Primārais stars
Sekundārie stari

30. Izkliede no molekulas Primārais stars
Molekula sastāv no vairākiem atomiem
Atomu sastāvā ir elektroni
Ja molekulu apstaro ar rentgenstariem, katrs elektrons izstaro (izkliedē) sekundāros rentgenstarus
Izstarotie rentgenstari mijiedarbojas viens ar otru un veido interferenci
Kopējā rentgenstaru izkliede no molekulas ir atkarīga no elektronu skaita un to savstarpējā novietojuma
Citiem vārdiem sakot, izkliede ir atkarīga no molekulas struktūras
Ja mēs zinātu izkliedēto staru amplitūdas un fāzes, vai varētu aprēķināt molekulas struktūru?
Primārais stars

31. Furjē transformācija F(k)= f(x)e-2pikx dx
Elektronu blīvuma sadalījums molekulā un molekulas veidotais rentgenstaru izkliedes attēls ir savstarpējas Furjē transformācijas
Tātad – ja varētu izmērīt vienas molekulas izkliedēto rentgenstaru amplitūdas un fāzes, struktūras aprēķins būtu trivāls
Bet ir divas problēmas...

32. Praksē...
Izkliede no vienas molekulas ir pārāk vāja, lai to varētu detektēt
Izkliede no daudzām molekulām atšķirīgās orientācijās (piem. šķīdumā) novedīs pie izkliedēto staru savstarpējas dzēšanās
Ja molekulas ir orientētas visas vienā virzienā (kā kristālā), rentgenstaru izkliede pastiprināsies noteiktos virzienos

33. Brega likums
Izkliedētie stari ir vienā fāzē, tie summējas
Izkliedētie stari ir pretējās fāzēs, tie savstarpēji dzēšas
nl = 2d sinq
Brega likums nosaka, ka izkliedētie stari summējas, ja to ceļu garumi atšķiras par n veseliem viļņa garumiem

34. Tipisks difrakcijas attēls no proteīna kristāla
Uz viena attēla ir tikai neliela daļa no visiem teorētiski iespējamajiem difrakcijas punktiem
Kristālu pagriež pa grādiem un iegūst nākošo attēlu un tā tālāk
Atkarībā no vienības šūnas izmēra un izšķirtspējas ir jāsavāc attēlu ar difrakcijas punktiem

35. Izšķirtspēja Mazākais attālums, ko var izšķirt elektronu blīvuma kartē
Atbilst mazākajam attālumam starp atstarojošām plaknēm, kurām var saskatīt difrakcijas punktus
Augstas izšķirtspējas difrakcijas punkti ir tālāk no attēla centra
Izšķirtspēja ir atkarīga no tā, cik perfekti ir izkārtotas vienības šūnas 2Å 3Å 5Å
10Å

36. No kā atkarīga kristāla kvalitāte?
Augstas izšķirtspējas kristāls
Zemas izšķirtspējas kristāls
No kā atkarīga kristāla kvalitāte?
-No molekulu kontaktiem kristālā – no to skaita (vairāk=labāk) un rakstura
-No molekulu fleksibilitātes (jo fleksiblāka, jo sliktāk)

37. Vai kristālu ārējam izskatam ir korelācija ar izšķirtspēju?
Kamolzāles raibuma vīrusa kristāli, izšķirtspēja 3.7Å
Tā paša vīrusa kristāli (audzēti citos apstākļos). Izšķirtspēja 2.6Å
Īpašas korelācijas nav
Vienīgais veids kā pārbaudīt kristālu kvalitāti ir ievietot tos rentgenstaros

38. Fāzes problēma
Ar detektoru var izmērīt tikai difrakcijas punktu intensitāti
Informācija par fāzēm netiek fiksēta – nav tādas ierīces, kā “fāzesmetrs”
Tas nozīmē, ka informācija par fāzēm ir jāiegūst netieši
Mazām molekulām (<100 atomu) eksistē tiešās metodes. Tas nozīmē, ka fāzes var izskaitļot no amplitūdām bez jebkādas papildus informācijas.
Proteīni ir daudzkārt par lielu lai izmantotu tiešās metodes, tāpēc ir izstrādātas citas metodes

39. Mazās molekulas (<100 atomu)
Difrakcija
NaCl
NaCl
NaCl
NaCl
Struktūras aprēķins tikai no punktu intensitātēm
Proteīni (>>100 atomu)
Difrakcija
Struktūras aprēķins tikai no punktu intensitātēm

40. Izomorfā aizvietošana
Ieviešot proteīnu kristālos smagos atomus, difrakcijas punktu intensitāte izmainās
No izmaiņām var noteikt smago atomu atrašanās vietas un no tām - fāzes
Jāizmanto vismaz divi dažādi smagie elementi

41. Pb2+ A-B B A Fāzes aprēķins
Smago metālu struktūras aprēķins kā mazajām molekulām
Fāzes aprēķins

42. Izomorfās aizvietošnas problēmas:
1) Vienības šūnas izmēri var izmainīties. Tas izmainīs difrakcijas režģi un metodi vairs nevar izmantot
2) Proteīna struktūra vai tā orientācija vienības šūnā var izmainīties
3) Kristālu var sabojāt, to mērcējot smago elementu šķīdumā
4) Smagie atomi var nepiesaistīties noteiktās vietās
-Problēmas daļēji iespējams risināt, proteīna sastāvā ieviešot selenometionīnu (Selēns ir smags elements)

43. Molekulārā aizvietošana
Šobrīd visizplatītākā metode
Var pielietot tikai tad, ja ir zināma līdzīga proteīna struktūra (vismaz 25% sekvences identitāte)
Zināmās struktūras fāzes tiek kombinētas ar nezināmās struktūras amplitūdām
Kombinēšana ir iespējama tikai tad, ja abu struktūru kristālu vienības šūnu parametri ir identiski un molekulas tajā ir identiskās orientācijās

44. Fāzes nav zināmas!
Novērotās amplitūdas
Nezināmā struktūra
FFT
Kaķis
Furjē kaķis
Zināma struktūra
Izskaitļotās amplitūdas un fāzes
Bezastes kaķis
FFT
Furjē bezastes kaķis

45. Novērotās amplitūdas, izskaitļotās fāzes
FFT
Aste ir redzama!

46. Ja struktūras nav pietiekoši līdzīgas...
Pīle
Furjē pīle
Pīles amplitūdas + kaķa fāzes
Kaķis !!!???

47. Kā praksē kombinēt fāzes un amplitūdas
Fāzes un amplitūdas ir iespējams kombinēt tikai no kristāliem ar identiskiem vienības šūnu izmēriem
Ja kristālu simetrija vai vienības šūnas izmēri atšķiras, iegūst dažādus difrakcijas režģus
Praksē zināmās un nezināmās struktūras proteīnu kristāliem reti kad ir vienādi vienības šūnu parametri
Tādēļ nepieciešams zināmo struktūru ievietot teorētiskā kristālā, lai sakristu vienības šūnu parametri un molekulu orientācija
Kā noteikt molekulu orientāciju nezināmajā struktūrā???

48. Teorētiskā difrakcijas režģa aprēķins zināmai molekulai virtuālā kristālā
Furjē
transformācija
Furjē
transformācija

49. Rotācijas un translācijas funkcijas
Uzdevumu matemātiski iespējams sadalīt divās daļās – rotācijas meklējumā un translācijas meklējumā (funkcijās)
Zināmo molekulu daudzās dažādās orientācijās ievieto virtuālajā kristālā, kura vienības šūnu izmērs ir tāds pats kā nezināmās struktūras eksperimentāli iegūtajam kristālam
Katrai orientācijai izskaitļo Furjē transformāciju un iegūst teorētiskās intensitātes
Pareizajā orientācijā ir visaugstākā eksperimentālo un teorētisko intensitāšu korelācija

50. A un B orientācijas ir atšķirīgas
Zināma struktūra A
Nezināma struktūra B
A un B orientācijas ir atšķirīgas
Furjē transformācija
Difrakcijas punktu intensitātes ir ļoti atšķirīgas

51. A un B orientācijas ir līdzīgas
Zināma struktūra A
Nezināma struktūra B
A un B orientācijas ir līdzīgas
Furjē transformācija
Difrakcijas punktu intensitātes ir līdzīgas

52. Modeļa veidošana
Proteīnu sekvences savietošana ar novēroto elektronu blīvumu
Vienkārša molekulārajā aizvietošanā
Sarežģītāka, ja nav līdzīgas zināmas struktūras
Viennozīmīga pie pietiekoši augstas izšķirtspējas (labākas par 3.0 Å)
Var tikt automatizēta, ja izšķirtspēja ir 2.5Å vai labāka

55. 2.0 Å

56. Rifainments (Refinement)
Automatizēta modeļa uzlabošana, lai labāk izskaidrotu eksperimentālās amplitūdas
Arī fāzes tiek uzlabotas, tādejādi uzlabojas elektronu blīvuma kartes kvalitāte

57. Validēšana Finālā (?) modeļa kvalitātes pārbaude
Kā izskatās aminoskābju ģeometrija? (Ramačandrāna plots, u.c.)
Vai nekovalenti saistītie atomi ir pietiekoši tālu viens no otra?
Vai aminoskābes iederas apkārtējā vidē? (Hidrofobās proteīna iekšienē, polārās uz virsmas)
Vai ūdeņraža saišu donori/akceptori ir kompensēti?

58. Deponēšana
Struktūras deponēšana PDB datu bankā ir priekšnosacījums publicēšanai žurnālos
Vajadzētu deponēt arī eksperimentālos datus, lai būtu iespējams ģenerēt elektronu blīvuma karti un pārleicināties, ka modelis tai atbilst

59. Neuzmanības rezultātā...

60. Zinātnieks no Scripps institūta publicēja divas pilnīgi nepareizas struktūras
Struktūras izraisīja milzīgu interesi, jo bija ļoti atšķirīgas no gaidītā
3 raksti Science, viens JMB un viens PNAS
Pēc kļūdas noskaidrošanas, visi raksti tika atsaukti
Viss finansējums un prezidenta dotās medaļas atņemtas...
Veicot vienkāršu validēšanu, no tā visa varētu izvairīties