1. Biotechnologija ir selekcija
6.2 Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje ir miškų ūkyje

2. Selekcija mikrodauginimas
Mikrodauginimo panaudojimas selekcijoje
Palikuonių šeimų individų klonavimas kloniniams testams, skirtiems padidinti klasikinio selekcinio testavimo tikslumą ir efektyvumą.
Geriausių genotipų dauginimas klonams testuoti kloniniuose bandymuose (pvz. drebulės ar tuopų hibridų).
Mikrodauginimas selekcionuotų klasikiniu būdu arba GM palikuonių testavimui in vitro (šalčio ar karščio poveikiui, herbicidams, atsparumo grybams ir kt.) ir ląstelinei selekcijai.
Mutacijų ir epigeninio kintamumo indukcija geriausiuose klonuose in vitro
Patogenų pašalinimas iš selekcinės medžiagos

3. Selekcija mikrodauginimas
Mikrodauginimo panaudojimas sėklininkystėje, genetiniams ištekliams išsaugoti ir miškų ūkyje
Specialių, poskiepiams skirtų, genotipų dauginimas žemaūgėms gausiai ir anksti derančioms selekcinėms populiacijoms ir miško sėklinėms plantacijoms veisti.
Mikrodauginimas pažeistoms ar nykstančioms genetinių išteklių populiacijoms (genetiniams draustiniams) atkurti (jei menkas dėklų derlius).
Mikrodauginimas genetiniams ištekliams saugoti in vitro genų bankuose.
Testuotų genotipų (pirmyn nukreipta selekcija) ar geriausių šeimų motinmedžių (sangrąžinė selekcija) mikrodauginimas sėklinėms plantacijoms veisti (pakeičiant skiepijimą).
Selekcionuotos klasikiniu būdu arba genetiškai modifikuotos genetiškai identiškos selekcinės medžiagos masinis dauginimas miško želdiniams veisti.

4. Biotechnologija paremta selekcija vykdoma kloninės selekcijos pagrindu, kuri integruota į klasikinę selekciją
Klon selekc schema
Palikuonių bandomieji želdiniai
Sėklinės
plantacijos
Miško
želdiniai
Testavimas
Įvertinimas
Atranka
Kryžminimas
A. Fenotipų klonai
Dauginimas gyvašakėmis
Audinių kultūra
Testavimas
Įvertinimas
Atranka
B. Genotipų klonai
Dauginimas in vitro arba gyvašakėmis
C. Patikrinti klonai
Testavimas
Įvertinimas
Atranka
Plantaciniai
želdiniai
Klonų testavimo želdiniai

5. Kloninės selekcijos efektyvumas
Klon selekcija
Kloninės selekcijos efektyvumas
Generatyviniu būdu padauginant atrinktus geriausius individus (klonuojant) gaunamas didesnis selekcinis efektas (genetinė nauda) nei padauginant sėkliniu būdu, nes panaudojamas ne tik adityvinis bet ir dominantinis efektas, išvengiama nepalankių rekombinacijų bei apsidulkinimo nepagerintų populiacijų (sėklines plantacijas supančių aplinkinių medynų) žiedadulkėmis
Prieš dauginant, būtina atlikti geriausių fenotipų generatyvinių palikuonių (klonų) testavimą kloniniuose želdiniuose, tuo būdu, nustatant genotipines požymių reikšmes, ir tik po to atrinkti geriausius individus (genotipus) masiniam klonavimui. Dauginti nepatikrintus geriausius fenotipus nepilnai išnaudojamas kloninės selekcijos galimybės. x
Tradicinė selekcija x x
Kloninė selekcija
Genetinė nauda
Tradicinė selekcija
Kloninė selekcija

6. Schema I II III Daugiaciklės pirmyn nukreiptos selekcijos schema 25 -I II
III
25 -
20 -
15 -
10 -
5 -
0 -
Sekecijos ciklas
Klonai testavimui ir masiniam dauginimui
Klonai testavimui ir masiniam dauginimui 20
Testavimas 50
Klonai II kartos sėklinėje plantacijoje
F3 pali-kuonys
10 000
Pliusinių medžių skiepyti klonai I-os kartos sėklinėje plantacijoje
Testavimas
Selekcinė populiacija 20 50
Selekcinis efektas pagal medžių aukštį, %
F2 pali-kuonys
10 000
Pliusiniai medžiai
Testavimas 20 50
Testavimas
F1 pali-kuonys
10 000 50
300
Gamtinės populiacijos
Laikas, metais

7. Selekcijos efektyvumas
Skirtingų selekcijos rūšių efektyvumas pagal augimo spartą
70 -
60 -
50 -
40 -
30 -
20 -
10 -
0 -
Genų inžinerija ir išbandytų klonų atranka
Išbandytų klonų atranka
Selekcinis efektas, %
Atrinktų fenotipų klonavimas
Fenotipų atranka geriausiose šeimose
Išbandytų šeimų atranka
Populiacinė atranka
Fenotipinė pliusinių medžių atranka
Provenencijų/kilmių/sėklinis rajonavimas

8. MPBS
Vykdant miško medžių selekciją pagal daugiapopuliacinės sistemos (MPBS) principus, bendroji selekcinė populiacija suskaidoma į skirtingas selekcines populiacijas pagal aplinkos sąlygas (augavietę, klimatą).
Kas generaciją prarandama tik 1% adityvinės variacijos populiacijų viduje, tačiau nuosekliai plėtojama tarppopulacinė variacija.
Selekcinis efektas
Skirtingos selekcinės populiacijos
Našiose augavietėse + tręšimas
MPBS
Našiose augavietėse
Vidut. našumo augavietėse
Neturtingose augavietėse
Neturting. augavietėse, be selekcijos
Laikas – generacijų skaičius
Pagal Eriksson, 2001

9. MPBS
Daugiapopuliacinė selekcijos sistema (MPBS) leidžia kryptingai formuoti selekcinių subpopuliacijų adaptaciją ir plėtoti tarppopuliacinę variaciją.
Be to, susidaro galimybė sukurti specializuotas selekcines populiacijas ne tik pagal aplinkos sąlygas, bet ir pagal planuojamą želdinių tipą (pvz. trumpos apyvartos želdiniai) ar tikslinę produkciją (pvz. aukštos kokybės medienos) ir kt.

10. Vegetatyvinių palikuonių Vegetatyvinis dauginimas
Metodai
Alternatyvos
Selekcinė sistema:
Įprastinė
nestruktūrizuota
Daugia-
populiacinė
Atvirų
branduolių
Principinė metodų parinkimo schema miško selekcijos programoje.
Atviro
apsidulkin.
Polikro-sas
Viengubo
porų kryžm.
Dvigub.porų
kryžminimai
Faktorialin.
kryžmin.
Dialelin.
kryžmin.
Poravimai:
Randomizuoti
Asortatyviniai
Subalansuoti
Nesubalansuoti
Testavimas:
Trumpalaikis -2-5 met.
Vidutinio ilg met.
Ilgalaikis met.
Generatyvinių palikuonių
Vegetatyvinių palikuonių
Raudona punktyrine linija sujungta labiau paplitusioms Lietuvos socialinių lapuočių medžių rūšims taikoma vidutinio intensyvumo selekcijos principų ir metodų kombinacija
Vieno medžio laukeliai
Maži laukeliai (5-10)
Dideli laukeliai (>10)
Viename prov.raj.
Keliuose proven.rajonuose
Atranka selekcinei populiacijai:
Neapribota
Tarpšeimyninė
Šeimų viduje
Klonų atranka
Pirmyn nukreipta
Sangrąžinė
Subalansuota
Nesubalansuota
Apribotų tėvų
Pagal giminystės laipsnį
Atranka produkcinei populiacijai:
Neapribota
Tarpšeimyninė
Šeimų viduje
Žalia punktyrine linija sujungta tuopoms bei eglei taikytina intensyvi kryžminimų ir kloninės selekcijos principų ir metodų kombinacija
Subalansuota
Nesubalansuota
Apribotų tėvų
Pagal giminystės laipsnį
Elitinės linijos
Apjungtos elit. linijos
Produkcinė
populiacija:
Generatyvinis dauginimas
Vegetatyvinis dauginimas
Sėjinukų sėklin.
plantacijos
Skiepytų klonų
sėkl.plantacijos
Kontroliuojami
kryžminimai
Makro-
Mikro-
Bikloninės
(2 klonai)
Mažo klonų skai-
čiaus (15-30)
Daugiakloninės
(35-50)
Mažesni kaštai
Didesni kaštai
Mažesnė genetinė nauda
Didesnė genetinė nauda

11. Ląstelinė selekcija in vitro
Lasteline selekcija
Ląstelinė selekcija in vitro
Ląstelinė selekcija – tai naujų genotipų kūrimas, selektyvinėmis sąlygomis in vitro išskiriant mutantines ląsteles.
Teorinė ląstelinės selekcijos prielaida – labai didelėje ląstelių populiacijoje yra didesnė tikimybė rasti ląstelių su retomis mutacijomis (retaisiais aleliais).
Taikoma, kai selekcionuojamas medžio požymis pasireiškia ląsteliniame lygmenyje.
In vitro sąlygomis selekcionuojami šie požymiai:
atsparumas šalčiui,
atsparumas sausrai,
atsparumas patogenams,
atsparumas padidintai UV spinduliuotei,
atsparumas padidintam ozono kiekiui,
atsparumas herbicidams,
atsparumas dirvos/kritulių rūgštingumui,
atsparumas sunkiesiems metalams ir kt.

12. Išskiriami du ląstelinės selekcijos būdai:
Lastel sel medziaga
Išskiriami du ląstelinės selekcijos būdai:
Somatinių ląstelių selekcija
Gametinė ir zigotinė selekcija
Ląstelinės selekcijos medžiaga:
                                                          
somakloninės ląstelės - ieškomi reti savaiminiai somakloniniai mutantai,
genetiškai modifikuotos ląstelės,
poliploidizuotos ląstelės (pvz., kolchicino pagalba),
dirbtinės mutagenezės pagalba gautos ląstelės,
haploidinės ląstelės - gametos ir zigotos
Ląstelinė selekcija gali būti atliekama skirtingais biologinės medžiagos lygmenimis:
ląstelių suspensijos
kaliaus,
somatinių gemalų,
mikrosporų ir kt.

13. Ląstelinės selekcijos in vitro pranašumai:
Lastel sel pranasumai
Ląstelinės selekcijos in vitro pranašumai:
galimybė įvertinti labai daug ląstelių (šimtus tūkstančių) nedideliame plote (keliose Petri lėkštelėse vietoje kelių ha ploto lauko bandymų),
galimybė padidinti pradinės medžiagos genetinę įvairovę įvairiais mutagenezės metodais (somakloninė, cheminė, radiacinė mutagenezė, GMO, poliploidija ar haploidija ir kt.)
galimybė vienu metu tirti skirtingus genotipus,
lengvai kontroliuojamos auginimo ir selekcinio fono sąlygos,
vienodos auginimo sąlygos palengvina mutantų identifikaciją,
darbai nepriklauso ar mažai priklauso nuo metų sąlygų,
labai sutrumpėja selekcijos ciklo trukmė (mėnesiai vietoje metų),
labai sumažėja sąnaudos (nereikia veisti didžiulių bandomųjų želdinių, juos prižiūrėti, atlikti daug matavimų ir kt.)
lengva klonuoti genotipą iš atrinktos ląstelės,
kalius arba suspensija gali būti gauta beveik iš visų rūšių medžių,
mažiau teršiama aplinka kenksmingomis medžiagomis.

14. Išskiriami du pagrindiniai ląstelinės selekcijos darbų aspektai:
Lastel sel atranka
Išskiriami du pagrindiniai ląstelinės selekcijos darbų aspektai:
požymio testavimas – reikalingo požymio buvimo nustatymas,
atranka – ląstelių ar eksplantų su vertingu požymiu identifikavimas ir išskyrimas.
Ląstelinėje selekcijoje naudojami atrankos būdai:
masinė atranka – kai sunaikinamos ląstelės be požymio ir išlieka pavienės ląstelės su pageidaujamu požymiu, pvz. atsparumu šalčiui ar herbicidams, ar kt.
tiesioginė atranka – kai atrenkamos tiesiogiai turinčios pageidaujamą požymį ląstelės.
netiesioginė atranka – kai ląstelės atrenkamos pagal netiesioginį požymį.

15. Lastel sel efektyvumo salygos
Ląstelinės selekcijos efektyvumo sąlygos:
Kultūros in vitro genetinė įvairovė/genetinis kintamumas. Jis leidžia atrinkti mutantus.
Atrankos požymiai turi reikštis ląsteliniu lygmeniu ir nepriklausyti nuo audinio organizacijos.
Turi būti stipri koreliacija tarp požymio in vitro sąlygomis ir požymio lauko sąlygomis jauname amžiuje ir vyresniame amžiuje.
Selekcinis agentas. Tai gali būti pats patogenas arba patogeno metabolitas (gryna kultūra arba jo filtratas).
Tolygus poveikis. Svarbu visas ląsteles veikti vienodai tomis pačiomis sąlygomis.
Atrankos galimybės ir sąlygos. Kad atranka būtų sėkminga, selekcinis agentas turi užmušti jautrias ląsteles arba inhabituoti jų augimą, kad atsparios ląstelės galėtų jas peraugti.

16. Plantaciniai trumpos apyvartos želdiniai
Zeldiniu tikslai
Plantaciniai trumpos apyvartos želdiniai
Paskirtis:
Patenkinti biomasės ir popieriaus gamybos poreikius
Kompensuoti medienos resursų, gaunamų iš natūralių miškų, trūkumą
Tiekti biomasę energijos gamybai
Tiekti įvairius produktus vietiniam naudojimui (malkoms, tvoroms, kt. dirbiniams)
Apželdinti degraduotas žemes ar vandens apsaugines zonas
Atkurti miškus ne miško žemėse, tame tarpe - nebenaudojamose žemės ūkiui žemėse
Sudaryti rinką anglies sekvestravimui (surišimui)
Išsaugoti genetinius išteklius ex-situ (ex situ kolekcijos)
Sukurti selekcines (palikuonių išbandymo) bei reprodukcines populiacijas
Utilizuoti (surišti) vandenvalos įmonių dumblą ar kitokias atliekas ar kenksmingas medžiagas
Išauginti medžius dekoratyviniam apželdinimui (t.t. – gatvėms apsodinti).
Išauginti naujametines eglutes ar medžius dekoratyviniam apželdinimui.
Gauti nemedieninius produktus (pvz., vaistus) ir kt.

17. Produkcija tr ap zeldiniuose
Prognozuojama, kad 2050 metais pasodinti ir intensyviai ūkininkaujami miškai pasaulyje sudarys 10-15% viso miškų ploto ir tenkins 80% viso medienos industrijos poreikių
Medienos gavyba sodintuose miškuose turėtų sumažinti natūralių miškų eksploatavimą ir padidinti natūralių miško sistemų tvarumą.
Perkėlus medienos gavybą į biotechnologinius trumpos apyvartos intensyviai tvarkomus sodintus miškus, 50% pasaulio miškų galėtų būti palikta rezervatiniais miškais.
Atskirose Ispanijos regionuose (pvz. Baskų) didžioji dalis medienos jau gaunama introdukuotų rūšių (Pinus radiata ir Eucalyptus spp.) trumpos apyvartos plantaciniuose želdiniuose

18. Plantac zeldiniu tipai
Plantaciniai želdiniai priklausomai nuo jų tikslinės paskirties ir auginimo trukmės klasifikuojami:
Želdinių tipas
Rotacijos trukmė, m.
Paskirtis
Auginamos rūšys
Labai trumpos apyvartos
4-15
Energetinei žaliavai (kurui)
Gluosniai (4-10 metų)
Tuopos (5-10 metų)
Alksniai (9-12 metų)
Beržai (12-15 metų)
Robinijos (12-15 metų)
Medienos masei
Gluosniai, tuopos, alksniai, beržai, robinijos (5-15 metų)
Vidutiniškai trumpos apyvartos
15-30
Popiermediams, fanermedžiams, pjautinei medienai
Tuopos, beržai, alksniai
Sutrumpintos apyvartos
40-50
Popiermedžiams, pjautinei medienai
Eglės, maumedžiai, pocūgės

19. Trumpos apyvartos plantaciniams želdiniams veisti naudojamos rūšys
Rusys
Trumpos apyvartos plantaciniams želdiniams veisti naudojamos rūšys
Pasaulyje
Eukaliptai (Ecalyptus grandis, E. globus)
Pietinės pušys (Pinus radiata, P. taeda, P. elliottii ir kt.)
Tuopų hibridai (Populus trichocarpa x P. deltoides, P. deltoides x P. nigra ir kt.)
Drebulių hibridai (P. tremuloides x P. tremula)
Lietuvos sąlygomis
Drebulių hibridai (P.tremuloides x P.tremula, P. tremula x P. alba)
Paprastoji eglė (Picea abies)
Tuopų hibridai (Populus deltoides x P. nigra, P. trichocarpa x P. deltoides, ir kt.)
Maumedis europinis (lenkinis) ir maumedžių hibridai (Larix decidua var.polonica. L. leptolepis x L. decidua( L. eurolepis))
Baltalksnis ir jo hibridai su juodalksniu (Alnus incana, A. incana x A. glutinosa)
Karpotasis beržas (Betula pendula)
Karklai (Salix spp.)

20. Klonine miskininkyste JAV
Per paskutinius 20 metų JAV įkurta nemažai didžiulių trumpos apyvartos tuopų plantacinių želdinių ūkių (farms)
Tuopų hibridų (Populus deltoides x P. nigra) transgeninis (kairėje) ir netransgeninis klonai

21. Tuopu zeld
Klonuotų hibridinių drebulių (Populus tremula x P. tremuloides) želdiniai Latvijoje
Tuopų hibridų (Populus deltoides x P. nigra) klonų sutrumpintos apyvartos želdinių metinis prieaugis Kanadoje siekia 8-15 m3 /ha, o šiaurės-centrinėje JAV – m3/ha

22. Eukaliptų plantaciniai želdiniai Brazilijoje
Eukaliptu zeldiniai
Eukaliptų plantaciniai želdiniai Brazilijoje
Pirmaujančiose šalyse - Brazilijoje, Argentioje ir Čilėje 8,6 mln. ha ploto plantaciniuose miškuose išauginama 180 mln. m3 medienos

23. Hibr drebule
Hibridinių drebulių plantaciniuose želdiniuose Suomijoje per 25 metus išauginama apie 300 ktm/ha medienos, kas yra % daugiau nei paprastosios drebulės ar karpotojo beržo ir 100% daugiau nei paprastosios eglės.
Hibridinių drebulių (Populus tremula x P. tremuloides) 23 metų amžiaus želdiniuose Dubravos EMMU medžiai jau pasiekė m aukštį.
(Kryžmino A.Pliūra ir R.Murkaitė 1982 m., veisė A.Malinauskas 1983 m.)

24. Galimas neigiamas plantacinės miškininkystės poveikis:
Galimas poveikis
Galimas neigiamas plantacinės miškininkystės poveikis:
Žala ekosistemoms dėl ekosisteminės įvairovės sumažėjimo plečiant monokultūras
Rūšių įvairovės praradimas
Genetinės įvairovės praradimas
Mažesnės adaptacijos ar kitaip modifikuotų genų išplatinimas į natūralius miškus
Naujų kenkėjų, atsparių modifikuotų genų gaminamiems toksinams atsiradimas
Naujų ligų, atsparių modifikuotų genų gaminamiems antibiotikams atsiradimas
Naujų piktžolių (piktmedžių) atsiradimas ir išplatinimas
Cheminių priemonių taikymo padidėjimas (kai naudojami herbicidams atsparūs GMO)
Per didelė miškų industrializacija ir komercializacija
ir kt.

25. Klonuotos reprodukcinės medžiagos kategorijos
Klonu kategorijos
Klonuotos reprodukcinės medžiagos kategorijos
(Beuker 2000, Suomija, pagal tarptautines rekomendacijas)
Kategorija
Reikalavimai
Lauko bandymų minimalūs reikalavimai
Maksimalus vieno klono sodmenų skaičius C3
Atrinkti klonai
Atrinktų klonų selekciniai kriterijai turi viršyti populiacijos, kurioje jie atrinkti, vidurkį - C2
Kvalifikuoti klonai
Atrinktų klonų selekciniai kriterijai turi viršyti lauko bandymų vidurkį (20% klaidos rizika)
2 bandymai numatome naudoti regione,
4 palyginamieji klonai,
5 auginimo sezonai. C1
Testuoti klonai
Atrinktų klonų selekciniai kriterijai turi viršyti lauko bandymų vidurkį (5% klaidos rizika)
12 auginimo sezonų,
4 pakartojimai bandyme,
23 kiekvieno klono rametos pakartojime

26. GMO misrinimas
Veisiant trumpos apyvartos želdinius naudojant genetiškai modifikuotus medžius, kuriems padidintas atsparumas ligoms, kenkėjams ar herbicidams, rekomenduojama mišrinti su nemodifikuotais sodmenimis, kad būtų išvengta genetiškai modifikuotų medžių toksinams, antibiotikams ar herbicidams atsparių kenkėjų, ligų ar piktžolių atsiradimo ir išplitimo
Genetinei įvairovei padidinti ir želdinių žuvimo rizikai sumažinti įvairiose šalyse taikomi maksimalaus vieno klonų rametų skaičiaus ir minimalaus klonų skaičiaus bei minimalaus blokų su skirtingais klonais skaičiaus želdomame plote apribojimai.
Mišrinimas skirtingais klonais gali būti daromas landšaftiniame lygmenyje amžiaus skalėje – kai skirtingais metais sodinami skirtingų klonų sklypai ar blokai

27. Klonu skaicius
Genetinei įvairovei išlaikyti veisiant klonų želdinius rekomenduojamas minimaliai būtinas klonų ir blokų skaičius (Beuker 2000, Suomija)
Želdinių plotas, ha
Medžių skaičius, vnt.
Blokų skaičius, vnt.
Klonų skaičius, vnt
0,2 – 0,4
200 – 400 1
0,4 – 0,5
400 – 500
1 – 2
0,5 – 0,8
500 – 800
2 – 3
0,8 – 1,0
800 – 1000
2 – 4
1,0 – 1,5
1000 – 1500
3 – 7
1,5 – 2,0
1500 – 2000
4 – 10
>3
2,0 – 2,5
2000 – 2500
5 – 12
>4
>2,5
>2500
Medžių sk./500
>5

28. Naudotos publikacijos
Beuker E Aspen breeding in Finland, new challenges. Baltic Forestry. 6 (2): 81-84
Desmond S. T. Nicholl An Introduction to genetic engineering (Studies in biology). Cambridge University Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN:
FAO, Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification. Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
Jain, S.M. and Ishii, K Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sciences, V.75, Kluwer Academic Publishers, ISBN:
Gartland, K.M.A, Kellison, R.C., Fenning, T.M Forest biotechnology and Europe’s forests of the future. Edinburgh, Scotland. 23 p.
Kirsi-Marja Oksman-Caldentey Plant biotechnology and transgenic plants. ISBN: X. Publisher: CRC.
Kreuzer, H and Massey, A Recombinant DNA and Biotechnology: A guide for teachers. American Society Microbiology; 2nd edition, ISBN:
Sliesaravičius, A, Stanys, V Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius, ISBN
Strauss S.H., Bradshaw H. D The bioengineered forest : Challenges for science and society. Resources for the future, ISBN:
Tourte, Y GMO: Transgenesis in plants. Science Publishers Inc. ISBN:
Vasil I.K The science and politics of plant biotechnology - a personal perspective. Nat. Biotechnol 21:
Ермишин А.П Генетически модифицированные организмы: мифы и реальность. Минск, с.