Download presentation
Presentation is loading. Please wait.
Published byDewi Santoso Modified over 6 years ago
1
عنوان: ساخت و اصلاح سطح در حسگرهای زیستی نانومکانیکی
نویسندگان : 1- شبنم هاشم زاده محسن سروری
3
ساخت کانتیلورها کانتیلورها سکوهای فنری در اندازههای نانو و میکرو میباشند که از یک انتها متصل و از انتهای دیگر آزادند. اتصال ماده مورد اندازهگیری به گیرنده ویژه در سطح کانتیلور سبب خمیدگی یا تغییر فرکانس رزونانس در انتهای آزاد کانتیلور میگردد. انعطاف پذیری ذاتی همراه با دسترسی به تکنیکهای طراحی شده برای نمایش خمیدگی، کانتیلورها را به ابزارهای قوی همه جانبه تبدیل کرده است.
4
ساخت کانتیلورها کانتیلورها نوعاً از Silicon/Silicon nitride یا مواد پلیمری ساخته میشوند. محدوده ابعاد کانتیلورها از دهها تا صدها میکرومتر طول و چند ده میکرومتر عرض و صدها نانومتر ضخامت میباشد. کانتیلیورها میتوانند بصورت آرایههايی شامل ده تا هزاران کانتیلور باشند. این ترکیبات جایگزین مناسبی برای تراشههای پروتئین و DNA رایج هستند.
5
ساخت کانتیلورها کانتیلورهایی که بصورت تجاری و در اشکال مختلف در اندازههای قابل مقایسه با کانتیلورهای(Atomic Force Microscopy) AFM موجودند عبارتند از: کانتیلورهای سیلیکون کانتیلورهای نیترید سیلیکون کانتیلورهای اکسید سیلیکون
6
ساخت کانتیلورها کانتیلورها با استفاده از تکنولوژی پروسه فیلم نازک مقاوم ساخته میشوند. با استفاده از این تکنولوژی کانتیلورهایی با مزایایی زیر فراهم میشوند: ارزان با بازده بالا امکان بازتولید خوب برای اجتناب از خمیدگی ذاتی کانتیلور، لایه ساختاری بايد از اختلاف فشار آزاد باشد.
7
ساخت کانتیلورها حساسیت کانتیلور به شدت تابع ثابت فنر میباشد.
هر چه ثابت فنر پایینتر باشد.... حساسیت اندازهگیری بر مبنای روش استاتیک در مایعات بالاتر است. عامل کلیدی که شدیداً ثابت فنر کانتیلور را متأثر میکند، ضریب یانگ است. این ضریب مستقیماً با خواص ماده کانتیلور ارتباط دارد. کانتیلورهای ساخته شده از سیلیکون یا مواد مرتبط ضریب یانگ بالایی دارند. کانتیلورهایی که از مواد نرمتر ساخته میشوند، برای اندازهگیری انحراف استاتیک بسیار حساس خواهند بود.
8
ساخت کانتیلورها پلیمرها با ضریب یانگ خیلی کمتر از سیلیکون بعنوان ماده جایگزین برای ساخت کانتیلورها استفاده میشوند. از میان پلیمرها، پلیمر SU-8 بسیار حساس است. ثابت یانگ SU-8، حدود 40 برابر کمتر از سیلیکون است. ویژگیهای روش استفاده از پلیمر در ساخت کانتیلورها: ارزان سریع قابل اطمینان
9
ساخت کانتیلورها اصلاح شکل و ابعاد کانتیلورها ثابت فنر را بهبود میبخشد. هر چه کانتیلور طولانیتر و نازکتر باشد... ثابت فنر کوچکتر و کارایی بهتر خواهد بود.
10
ساخت کانتیلورها راهکارهای جدید ساخت در جهت افزایش پاسخ کانتیلور:
مینیاتوریزه کردن کانتیلور تا مقیاس نانو ثابت فنر نانوکانتیلورها بزرگ است و برای آشکارسازی خمیدگی ناشی از جذب سطحی کانتیلور نامناسباند. نانوکانتیلورها برای اندازه گیریهای دینامیک با حساسیت بسیار بالا بکار میروند.
11
ساخت کانتیلورها انتظار میرود نانوکانتیلورها آشکارسازی جرمی با حساسیت بسیار بالا، فراهم کنند و نهایتاً به سطح تک مولکولی برسند. بر ساختارهای نانو برای افزایش سطح فعال تمرکز میشود. پوشش سطح با نانوذرات طلا مثالهایی از این جهت گیریاند. این پوشش ثابت فنر را کاهش میدهد و میتواند پاسخ کانتیلور را با توان دوم افزایش دهد. سطوح فعال وسیعتر نانوساختاری، تعداد سایتهای پیوندی برای آنالیت را افزایش میدهند.
12
ساخت کانتیلورها همراهی سامانه قرائت با کانتیلور، سبب قابل حمل شدن مجموعه شده و کاهش در هزینه و افزایش در سرعت عمل را به همراه خواهد داشت. با این تکنیکS/N (نسبت سیگنال به نویز) افزایش یافته و حساسیت به مداخلات بیرونی کم میشود. این وضعیت امکان عملکرد مستقل از کنترلهای بیرونی را فراهم میکند.
13
ساخت کانتیلورها با استفاده از کانتیلور رفرنس نیز میتوان نویز را در سیگنال خروجی کاهش داد. در این حالت، حرکات کانتیلور آزمایشی در مقایسه با کانتیلور رفرنس بررسی میشود. کانتیلور رفرنس تنها تحت تاثیر محرکهای خارجی ناخواسته به حرکت در میآید.
14
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
کلید استفاده از کانتیلورها برای آشکارسازی گزینشی مولکولها... قدرت عاملدار کردن یک سطح کانتیلور است. روش عاملدار کردن به صورتی است که مولکول هدف به طور اختصاصی به سطح عاملدار باند میشود. حساسیت، بازتولید و آنالیز مستقیماً تحت تاثیر پذیرنده (Receptor) تثبیت شده بر کانتیلور است.
15
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
لایه پذیرنده میبایست دربرگیرنده خصوصیات زیر باشد: نازک (برای جلوگیری از تغییرات در خواص مکانیکی کانتیلور) یکنواخت (برای تولید فشار سطحی بزرگ و یکنواخت) متراکم (برای پیشگیری از برهمکنش با بستر جامد زیرین) از اجازه دسترسی توسط مولکول هدف برخوردار باشد. پایدار و قوی باشد.
16
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
پذیرنده باید بطور کووالانسی روی سطح تثبیت شود. مولکولهای پذیرنده باید از درجه آزادی کافی برای برهمکنش با لیگاند ویژه در محیط برخوردار باشند. فعالیت پذیرنده میبایست از نظر زمانی دوام داشته باشد. امکان بازتولید لایه حسگر (Reproducibility) وجود داشته باشد تا امکان استفاده مجدد فراهم شود.
17
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
فلزات نجیب اغلب بعنوان بستر جهت تثبیت لایهها یا بعنوان کاتالیست برای جذب سطحی گاز روی کانتیلور تثبیت میشوند. تبخیر و پخش امکان کنترل دقیق ضخامت و توزیع لایه فلزی را فراهم میکند.
18
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
معمولاً سطح کانتیلور با یک لایه نازک از طلا پوشیده میشود. این پوشش فرصتی عالی برای ایجاد تک لایه خود انباشته (SAM- Self Assembled Monolayer) از مواد تیولدار فراهم میکند. طرف دیگر این ترکیب تیولدار متناسب با آنالیت یا پذیرنده انتخاب میشود. گروه سولفور در زنجیر تیول تمایل زیادی به اتصال با سطح طلا دارد. بنابراین تک لایه چگال و پایداری ایجاد میشود.
19
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
پوشش طلا موجب افزایش انعکاس سطح میشود. سطح طلای خالص در تماس با هوا انرژی آزاد سطح بزرگی دارد. در معرض آلکیل تیولها در فاز گاز پاسخ بزرگی نسبت به پیوند کووالان تیول- طلا نشان میدهد. روشهایی برای تثبيت مستقیم مولکولهای زیستی بر SU-8 بدون نیاز به لایه طلا ایجاد شدهاند.
20
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
برای بهبود پاسخ کانتیلور در محیطهای آبی از سطوح با ساختارهای نانو و اصلاح با SAM استفاده میشود. ایجاد ساختارهای نانو سبب افزایش سطح در دسترس برای SAM و پیوند آنالیت شده و مانع خروج پوشش از حالت یکنواختی است. ایجاد خوشههای فلزی نانو روی یک طرف کانتیلور سبب افزایش بزرگی در انحراف ناشی از آنالیت میشود. از نتایج مهم اصلاح با کلوئید و خوشه افزایش سطح است. با افزایش سطح نانوساختاری، سطح و فاز پذیرنده در دسترس و در نتیجه پاسخها افزایش مییابد و حساسیت بالا میرود.
21
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
فاکتور افزایش برابر است با: پاسخ به کانتیلور صاف/پاسخ به کانتیلور نانوساختار اصلاح با نانوساختار نویز را بطور جزئی افزایش میدهد. حد تشخیص (LOD) و گستره پویایی (Dynamic Range) را بهتر میکند. تغییر در ماده شیمیایی و نانوساختار منجر به انواع اصلاح در سطح کانتیلور و انتخابگری (Selectivity) میشود.
22
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
تنوع پوششهای بکار رفته بر سطح کانتیلور سبب افزایش حساسیت و انتخابگری میشود. کانیتلورهای پوشش یافته با پلی دی متیل سیلوکسان و فیلم نازک فازهای ساکن کروماتوگرافی پلیمری، برای آشکارسازی ترکیبات آلی فرار بکار میروند. پوششهای طلا برای آشکارسازی آلکان تیولها بکار میروند.
23
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
سل – ژل در بيشتر كاربردها بعنوان ماتريكس پايه متخلخل بكار ميرود كه گونههاي آناليت به صورت انتخابي در آن به تله ميافتند. به دلیل اينكه ژلاتين ميتواند در دماهاي پايين تنوعي از مواد حساس به دما را كپسوله كند، فرايند سل ژل کاربردی است.
24
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
قرارگیری مستقیم DNA پروب از طریق خودانباشتگی الیگونوکلوئید نشاندار با تیول روی کانتیلورهای طلا پوش از سهولت و رواج بالایی برخوردار است.
25
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
هرن و تارلو تثبیت الیگونوکلئوتیدهای DNA تک رشته روی طلا از طریق اتصال سولفور را نشان دادند. اتم سولفور تغییر بزرگی را در فشار سطحی از طریق تثبیت DNA در تباین با DNA غیراصلاح شده باعث میشود. پوشش سطحی مستقیماً سرعت هیبریداسیون را متأثر میکند. غلظت بافر محلول DNA تیوله با کاهش برهمکنشهای غیرکووالانسی در غلظتهای پایین نمک، اثر عمدهای بر پوشش سطح دارد.
26
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
جذب سطحی کووالانسی پروتئینها بر سطح طلای کانتیلور با تنوع وسیع فرآیندهای شیمیایی بدست میآید. این عمل پایداری و بازتولید پوشش پروتئینی را تضمین میکند.
27
اصلاح و عاملدار کردن کانتیلورها
مشکل عمده جذب سطحی شیمیایی این است که... بعضی از گروههای عاملی میتوانند نسبت به جهتگیری سایتهای فعال پروتئین تصادفی عمل کنند. این حالت منجر به جلوگیری از پیوند با آنالیت میشود. انتخاب فرآیند مناسب تثبیت به منظور اجتناب از سرعت پایین فعالیت پذیرنده پروتئین امری کلیدی است.
28
افزودن آنالیت برهمکنش آنالیت پذیرنده میتواند برگشتپذیر یا برگشت ناپذیر باشد. در حضور چندین آنالیت و پذیرنده اتصال آنالیت به پذیرنده میتواند: رقابتی (Competitive چند آنالیت به یک پذیرنده) یا غیررقابتی (هر آنالیت به یک پذیرنده) باشد. میزان تمایل آنالیت به پذیرنده مشخص در یک سیستم رقابتی، میزان اشغال سایتهای پذیرنده توسط آن آنالیت را تعیین میکند. برای اتصالات باید زمان مناسبی تخصیص داده شود تا یک حالت پایدار و یکنواخت که برای آشکارسازی موردنیاز است، در سطح کانتیلور ایجاد شود.
29
اطلاعات حاصل از کانتیلور
غلظت آنالیت: تغییر فرکانس رزنانسی کانتیلور (روش دینامیک) یا شاخص خمیدگی سطح (روش استاتیک) با غلظت آنالیت متناسب است. محلول میتواند توسط مولکولهای خالص فراهم شود یا آنالیت بخشی از یک مخلوط پیچیده باشد. در حالت دوم، مولکولهای متعدد دیگری نیز میتوانند در نمونه مورد نظر با مولکولهای آنالیت همراه باشند. در این حالت با توجه به رابطه اختصاصی آنالیت با گیرنده سطح کانتیلور امکان اندازهگیری یک آنالیت در مخلوط پیچیده فراهم است.
30
اطلاعات حاصل از کانتیلور
سینتیک برهمکنشها: محاسبه سرعت از طریق نمایش زمان واقعی برهمکنش مقدور است. پیشرفت برهمکنش بطور کمی با تعیین دوره زمانی پاسخ مشخص میشود. دامنه و زمان واکنش قبل از حالت ایستای جدید اطلاعات مربوط به غلظت آنالیت و سینتیک برهمکنش را فراهم میکند. برای بررسی سینتیک برهمکنش آنالیت- پذیرنده فرآیند باید برگشتپذیر باشد.
31
کاربردهای تجزیهای کانتیلورها
کانیتلورها در آشکارسازی مواد شیمیایی مثل موارد زیر بکار می روند... ترکیبات فرار آلایندههای غذا و محیط مواد منفجره آفت کشها گونههای یونی سموم
32
کاربردهای تجزیهای کانتیلورها
کانیتلورها در آشکارسازی مواد بیولوژیکی مثل موارد زیر بکار میروند... آشکارسازی DNA آشکارسازی پروتئین آشکارسازی گلوکز
33
آشكارسازي يونها کلسیم یک یون مهم بیولوژیکی است.
آشکارسازی این یون در کاربردهای کلینیکی دارای اهمیت است.
34
آشكارسازي يونها تکنیک جدیدی برای آشکارسازی مقادیر در حد آثار یونهای کلسیم با استفاده از میکروکانتیلورهای اصلاح شده با تک لایههای خودانباشته انتخابگر یون، ابداع شده است. با غوطهورسازی کانتيلور در محلول M 3-10، 11-مرکاپتون دکانول و متانول لایه خود انباشته شکل میگیرد. زمانیکه کانتیلور با فسفوروس اکسی کلراید POCl3 تیمار میشود، حساسیت به یونهای کلسیم به حداکثر میرسد.
35
آشكارسازي يونها فشار سطح وقتی یونهای کلسیم از فلوسل عبور کرده و با گروههای فسفات برای ایجاد زوج یون ترکیب میشوند، تغییر میکند. در پی این عمل کانتیلور خم میشود. این کانتیلور به یونهای K+ و Na+ که در خون و بافتها به وفور یافت میشوند (به عنوان یونهای مزاحم) در غلظتهای زیر M 3-10 پاسخی نمیدهد.
36
آشکارسازی pH محلول pH محلول با استفاده از کانتیلورهای اصلاح شده سیلیکون (SiO2) و نیترید سیلیکون (Si3N4) قابل اندازهگیری است. سطح اصلاح شده کانتیلور باری متناسب با pH مایع محیطی جمع آوری میکند. کانتیلور در نتیجه فشار سطحی اختلافی خم میشود.
37
آشکارسازی pH محلول از طریق اصلاح شیمیایی با 4-آمینو بوتیل تری اتوکسی سیلان و 11- مرکاپتون دکانوئیک اسید و اصلاح فلزی Au/Al، pH در محدوده 12-2 قابل اندازهگیری است. کانتیلورهای SiO2/Au اصلاح شده با آمینوسیلان pH را در گستره 8-2 آشکارسازی میکنند. کانتیلورهای Si3N4/Au در گستره 6-2 و 12-8 بخوبی آشکارسازی میکنند. استفاده از آرایهای از کانتیلورها با پوششهای مختلف امکان آشکارسازی pH در محدوده 12-2 را فراهم میکنند.
38
آشکارسازی pH محلول ناحیه پاسخ دهی به pH و حساسیت (nm/pH) از کانتیلورهای مختلف
39
آشکارسازی مواد فرار: n- اکتان
كانتیلورهای SiNx به عنوان حسگرهای گازی مینیاتوری شده استفاده میشوند. کانتیلور به منظور اندازهگیری n- اکتان با پلی دی متیل سیلوکسان بعنوان لایه حسگر شیمیایی پوشیده ميشود. با بارگذاری از طریق جذب مولکولهای گازی و اندازهگیری تغییرات فرکانس رزونانسی سطح آشکارسازی میشود. برای آشکارسازی n - اکتان حساسیت 0.099Hz/ppm بدست آمده است.
40
آشکارسازی مواد فرار: n- اکتان
توسعه حسگرهای مینیاتوری شده برای آشکارسازی گازها و بخارات برمبنای کانتیلورهای تکی یا آرایههایی از کانتیلورها دستاورد مهمی است. در این روش غلظت مولکولهای آنالیت در لایه پلیمری میتواند تا توانهای 10 از غلظت آن در فاز گاز بیشتر باشد. سیگنال شیمیایی به شدت تقویت شده و باعث میشود چنین ابزارهایی نسبت به غلظتهای کم گاز بسیار حساس باشند.
41
آشکارسازی مواد فرار: n- اکتان
حسگرها میتوانند با پلیمرهای متفاوت با حساسیت ویژه نسبت به گازهای مختلف پوشش داده شوند. بداین ترتیب آرایهای از حسگرها حاصل میشود. در این روش مخلوطی از گازها میتوانند بطور همزمان آشکارسازی شوند.
42
آشکارسازی مواد فرار: n- اکتان
جابجایی فرکانس رزنانسی برای آنالیتهای مختلف متفاوت است. این امر بیانگر وابستگی تغییر فرکانس رزنانسی به برهمکنش بین پلیمر و مولکولهای آنالیت است.
43
آشکارسازی مواد فرار: n- اکتان
آشکارسازی کمی و کیفی بخارات آنالیت توسط آرایه کانتیلورهای سیلیکونی با تغییر مقاومت پیزو ناشی از تورم لایه پلیمری کانتیلور میسر است. ابزاری تحت عنوان بینی شیمیایی مصنوعی (Artificial Chemical Nose) ساخته شده که بطور همزمان به هشت آنالیت در فاز گاز پاسخ میدهد.
44
آشکارسازی مواد فرار: n- اکتان
این آنالیتها شامل موارد زیر میشوند: حلالهای شیمیایی سری همولوگ الکلهای اولیه اسانسهای طبیعی
45
آشکارسازی پروتئینها برای تشخیص بیماریهایی مثل سرطان...
آشکارسازی پروتئینهای چند گانه علائم بیماری مورد نیاز است. پروتئینها مستقیماً با بیماریهای مختلف در ارتباط هستند. امکان تشخیص دقیق بیماریها با آشکارسازی پروتئینهای مناسب فراهم میشود.
46
آشکارسازی پروتئینها آشکارسازی از طریق تغییرات فشار سطحی اتصالات ویژه Ag-Ab توسط پاسخ نانومکانیکی مستقیم میکروکانتیلورها صورت گرفته است. یک سنسور مقاومتی پیزو تغییر مقاومت فیلم با توجه به فشار سطح ناشی از اتصال ویژه زیست مولکولها را اندازه میگیرد. با اتصال آنالیت به پذیرنده، کانتیلور خم شده و مقاومت لایه مقاومتی پیزو تغییر میکند.
47
آشکارسازی پروتئینها آنتی ژن ویژه پروستات (PSA) و پروتئینهای (CRP) C-reactive که علائم ویژه سرطان پروستات و بیماری قلبی هستند، به این روش آشکارسازی شدهاند. آنتی بادیها نسبت به آنتی ژنهای خود بسیار اختصاصی عمل میکنند. صحت نتایج حاصل از این روش و اثبات اختصاصیت پیوند Ag-Ab با آزمایشهای دیگر نظیر فلورسانس تأیید میشود.
48
آشکارسازی پروتئینها استفاده از آپتامرها (قطعات اسیدنوکلئیک سنتزی ویژه آنالیت) بعنوان عناصر تشخیص در زیست حسگرها امکان آشکارسازی سریع و آسان پروتئینها را فراهم میکند. خواص ویژه آپتامرها سبب تولید حسگرهای پایدار، حساس و انتخابگر، با امکان بازتولید و سازگار با وضعیت نمونههای واقعی میشود. آپتامرها در برابر تغییر شکل و دناتوره شدن (Denaturation) مقاوم هستند. آپتامرها توسط گروههای عاملی اصلاح شده و مستقیماً روی تراشههای زیستی تثبیت میشوند. در نتیجه لایههای پذیرنده بسیار مرتب ایجاد میکنند و قادرند مولکولهای کایرال (Chiral) را تشخیص دهند.
49
آشکارسازی پروتئینها آپتامرها بصورت سنتزی بدست می آیند و بسیار خالصاند. نسبت به دیگر گیرندهها کوچکترند و امکان تثبیت مؤثر در دانسیته بالا را فراهم میکنند. بنابراین تولید، مینیاتوری کردن و تجمیع آپتاحسگرها نسبت به زیست حسگرهای دیگر سادهتر است.
50
آشکارسازی پروتئینها آپتامرهای DNA معمولاً به لحاظ شیمیایی پایدار بوده و امکان استفاده مجدد از زیست حسگر وجود دارد. برعکس آپتامرهای RNA توسط آندو نوکلئازهایی که در سرم وجود دارند، تغییر شکل مییابند.
51
آشکارسازی پروتئینها زیست حسگرهای برمبنای آپتامرهای RNA فقط برای اندازهگیریهای محدود در محیطهای بیولوژیکی بکار میروند. برای پیشگیری از تغییرشکل آپتامر RNA اصلاح نوکلئوتیدهای پیریمیدین با گروههای آمینو پیشنهاد میشود.
52
آشکارسازی DNA الیگونوکلئوتیدهای DNA تک رشته از طریق اتصال سولفور میتوانند روی کانتیلور طلاپوش تثبیت شوند. این اتصال تغییر بزرگی در فشار سطحی از طریق تثبیت ssDNA نشاندار با تیول در تباین با ssDNA غیراصلاح شده نشان میدهد.
53
آشکارسازی DNA یک لایه حسگر میتواند با استفاده از تک رشته DNA تیوله متصل به بستر طلا ایجاد شود. پیزو مقاومت داخل این لایه فوراً به افزایش رشته DNA مکمل پاسخ میدهد و نسبت به رشتههای متفاوت انتخابگر است.
54
بحث و نتیجه گیری کانیتلورها در آشکارسازی مواد شیمیایی و مواد بیولوژیکی بکار میروند. حساسیت کانتیلور به شدت تابع ثابت فنر میباشد. عامل کلیدی که شدیداً ثابت فنر کانتیلور را متأثر میکند، ضریب یانگ است که مستقیماً با خواص ماده کانتیلور ارتباط دارد. پلیمرها با ضریب یانگ خیلی کمتر از سیلیکون بعنوان ماده جایگزین برای ساخت کانتیلورها در روش استاتیک استفاده میشوند. اصلاح شکل و ابعاد کانتیلورها میتواند ثابت فنر را بهبود بخشد. هر چه کانتیلور طولانیتر و نازکتر باشد ثابت فنر کوچکتر و کارایی بهتر خواهد بود.
55
بحث و نتیجه گیری نانوکانتیلورها ثابت فنر بزرگی نشان میدهند.
کلید استفاده از کانتیلورها برای آشکارسازی گزینشی مولکولها قدرت عاملدار کردن یک سطح کانیتلور به روشی است که مولکول هدف ترجیحاً به سطح عاملدار باند شود. بنابراین حساسیت و بازتولید و آنالیز مستقیماً تحت تاثیر پذیرنده تثبیت شده بر روی کانتیلور است. کانتیلورها در تعیین غلظت آنالیت و بررسی سینتیک برهمکنشها ابزارهای کارآمدی میباشند.
Similar presentations
© 2025 SlidePlayer.com. Inc.
All rights reserved.