1. Polimerāzes ķēdes reakcija – Polymerase Chain Reaction
PCR
Polimerāzes ķēdes reakcija – Polymerase Chain Reaction

2. Polimerāzes ķēdes reakcija
Metode noteikta DNS fragmenta pavairošanai
PCR ir vienkāršota DNS replikācija in vitro
Viena no visplašāk pielietotajām metodēm molekulārajā bioloģijā
Plaši pielietota citās sfērās – piem. kriminālistikā, paternitātes noskaidrošanā, diagnostikā, utt
1993. gadā par PCR atklāšanu tika piešķirta Nobela prēmija
Turpmāk tekstā kā PCR... Kur ta to tālāk izmanto.....paskaidrojums iegūst normalu DNS konc. , lai vispār ar to varētu strādāt. (pcr amplificē DNS līdz viegli detektējamam daudzumam). Molekulārās ģenētikas pamatmetode.
Metodes nozīme
Ātra un ērta metode, kas nodrošina ar tālākam darbam pietiekamu noteikta DNS fragmenta daudzumu. Jo ar to, ko mēs izdalām, teiksim no asinīm (nav runa par spaiņiem) nepietiek. Turklāt tur ir pilns komplekts ar visu un citādi iegūt vajadzīgo ir ļoti grūti (izmantojot šūnas)
Nobel Prize in Chemistry, 1993
Kary B Mulis

3. DNS replikācija in vivo
Galvenie DNS replikācijas posmi šūnās:
Helikāze atritina DNS dubultspirāli, iegūstot vienpavediena DNS (ssDNS)
RNS praimāze sintizē komplementārus RNS praimerus
DNS polimerāze piesaistās praimeru galos
Notiek komplementāra DNS fragmenta sintēze
Neaizmirsti pastāstīt par praimeru nepieciešamību (kā ir leading strand);

4. DNS replikācija in vitro
1. dsDNS denaturācija pie 96⁰C
2. Sintētisku DNS praimeru uzsēdināšana uz DNS
3. DNS polimerizācijas reakcija
DNA
pol
Vai denaturēšanu veicot atkārtoti, nediks denaturēts arī enzīms?
DNA
pol

5. Termostabilās DNS polimerāzes
Izolētas no augstās temperatūrās dzīvojošiem organismiem
Taq DNS polimerāze ir iegūta no termofīlas baktērijas Thermus aquaticus (izolēta Yellowstone nacionālajā parkā), kas dzīvo karstajos avotos 70⁰C temperatūrā un var izturēt 95⁰C temperatūru
Pfu DNS polimerāze ir iegūta no hipertermofīlas arheobaktērijas Pyrococcus furiosus (izolēta Vulkāna salā Itālijā), kas dzīvo ⁰C temperatūrā (optimāli – 100⁰C)
Taq polimerāze ir ātrāka un lētāka par Pfu polimerāzi
Pfu polimerāze ir precīzāka un nedaudz karstumizturīgāka

6. In vivo vs In vitro DNS replikācija
Galvenie in vivo DNS replikācijas posmi:
Helikāze atritina DNS dubultspirāli, iegūstot vienpavediena DNS;
RNS praimāze sintezē komplementārus RNS praimerus;
DNS polimerāze piesaistās praimeru galos;
Notiek komplementāra DNS fragmenta sintēze.
Galvenie in vitro DNS repkiācijas posmi:
DNS dubultspirāles atritināšanās notiek pie paaugstinātas tº;
Tiek izmantoti sintētiski DNS praimeri;
DNS polimerāze piesaistās praimeru galos;
Notiek komplementāra DNS fragmenta sintēze.
Noteikti jāatceras pateikt, ka DNS polimerāze pati nespēj uzsākt sintēzi pilnīgi no jauna, ir jābūt uzsintizētam jau nelielam DNS vai RNS fragmentam (praimerim), pie kura 3’ OH grupas polimerāze var klāt nukleotīdus.
PCR laikā DNS tiek pavairota pēc tiem pašiem principiem, kā tas notiek replikācijas laikā dzīvās šūnās.

7. PCR – DNS fragmentu eksponenciāla pavairošana
1.cikls
1. ciklā tiek uzsintezēti gari, nenoteikta izmēra fragmenti
2.cikls
2. ciklā dažu jaunsintezēto DNS pavedienu garums ir definēts
3.cikls
3. ciklā dažu dsDNS fragmentu garums ir definēts
Tālākajos ciklos,dsDNS fragmentu ar definētu garumu daudzums pieaug eksponenciāli

9. Polimerāzes ķēdes reakcija
Darba gaita:
1)Tiek pagatavots reakcijas maisījums:
Buferšķīdums
Mg joni
dNTP
Praimeris 1
Praimeris 2
Polimerāze
Matricas DNS
H2O
Iebāž PCR mašīnā konc. DNS, vispār laikam labāk gala konc. Rakstīt? Labāk blakus dzīvu piemēru un pateikt par buf. Atšķaidās 10x utt. MgCl konc var variēt, par laikiem arī .....LABĀK NEJAUKTIES AR KONCENTRĀCIJĀM?
Darba gaita:
Tiek pagatavots reakcijas maisījums:
Buferšķīdums – nodrošina optimālu vidi polimerāzes darbībai...
MgCl2, MgSO4 – Mg2+ jonu avots. Mg2+ veicina nukleotīdu pievienošanos (fosfordiestersaites veidošanos)
DMSO - veicina DNS ķēžu atdalīšanos. Šim nolūkam var lietot arī betaīnu.
dNTP - DNS polimēra monomēri
Praimeris 1
- sākot no praimera 3’ gala sākas DNS ķēdes sintēze.
Praimeris 2
Polimerāze - enzīms, kas veic sintēzi. PCR lieto termoizturīgas polimerāzes. Biežāk lietotā ir Taq polimerāze, kas iegūta no Thermophilus aquaticus.
Matricas DNS – DNS, uz kura pamata tiks sintezēti PCR produkti.
H2O līdz kop. tilpumam...

10. Polimerāzes ķēdes reakcija
2) Gatavo reakcijas maisījumu liek programmējamā termostatā.
3) Reakcijas gaita:
5min
30s
1min*** 8 A.
PCR stobriņš – PCR mašīnas bildīte un vēl ar ieliktiem stobriņiem.... Vēl varētu nobildēt stobriņu....
55º* - mainās atkarībā no praimeru sekvences
72º** - mainās atkarībā no izmantotās polimerāzes
1min*** - mainās atkarībā no fragmenta garuma

11. Praimeru dizains
Praimeri ir īsi (16-25nt) sintētiski vienpavediena DNS fragmenti, komplimentāri mērķa DNS
Katram praimerim ir t.s. kušanas temperatūra – t.i., temperatūra, pie kuras tas atdalas/pievienojas pie komplimentārās DNS
Praimeru uzsēdināšanas temperatūru parasti izvēlas aptuveni par 5⁰ mazāku, nekā kušanas temperatūru
Pie zemākas uzsēdināšanas temperatūras ir sagaidami nespecifiski blakus produkti
Īsiem (10-25nt) praimeriem aptuveno kušanas temperatūru var aprēķināt pēc formulas tm=4x(G/C) + 2x(A/T), kur (G/C) un (A/T) ir atbilstošo nukleotīdu skaits praimerī

12. Rezultātu analīze agarozes gēla elektroforēzē
4) PCR reakcijas maisījumu analizē agarozes gēla elektroforēzē
Ja nepieciešams, produkta zonu var izgriezt, DNS izdalīt un izmantot turpmākajiem eksperimentiem 1. 2. 3. 4. 5.
-kont.
100bp garuma marķieris P

13. PCR pielietojumi
DNS pavairošana tālākām manipulācijām – molekulārajai klonēšanai, sekvenēšanai, utt
Zinātniskiem, analītiskiem mērķiem – genoma analīzē, mākslīgu DNS konstrukciju analīzē
Klīniskajā diagnostikā – piem. patogēnu klātbūtnes noskaidrošanā
Kriminālistikā un tieslietu medicīnā – bioloģisku paraugu izcelsmes noskaidrošanā, paternitātes noskaidrošanā
Pārtikas produktu analīzē (piem., lai noskaidrotu, vai desās nav zirgu vai kaķu gaļa)

14. Paternitātes tests
Pamatojas uz faktu, ka katram indivīdam ir unikāls dažu nekodējošo sekvenču («short tandem repeats») komplekts
Sekvences atšķiras pēc garuma, tātad ir viegli identificējamas ar PCR
Puse no sekvencēm ir mantota no mātes, puse – no tēva
Kurš no puišiem ir laimīgais tēvs?