1. Petra Klodnerová Supervisor: Dr. Ing. Miroslav Čeřovský
Department of Food Preservation and Meat Technology, FPBT, VŠCHT Prague
Methods for determining the thermal resistance characteristics of microorganisms
Dobrý den dámy a pánové,
dovolte abych na závěr krátce pohovořila o možnostech stanovení termoinaktivačních parametrů mikroflóry.
Petra Klodnerová
Supervisor: Dr. Ing. Miroslav Čeřovský

2. Heat Preservation Aim of heat process:
elimination of key pathogens and spoilage microorganisms
maximum retention of nutritional and sensory characteristic of food products
performance of legislative requirements
Konzervace teplem je stále jednou z nejpoužívanějších metod mikrobiální stabilizace potravin a je jedním z kritických bodů při výrobě potravinářských produktů.
Cílem konzervace teplem je zajištění zdravotní nezávadnosti a jakosti výrobku a také splnění legislativních požadavků.
Musí být především zajištěna spolehlivá a trvalá inaktivace mikroorganismů, které by mohly tepelně ošetřenou potravinu nepříznivě měnit, přičemž zpracovávaný materiál musí být co nejméně poškozen.
Tzn., že varná hodnota by měla být co nejnižší. (Varná hodnota udává poškození sledovaného ukazatele působením teploty 100°C.)
Snažíme se tedy o minimální opracování materiálu, což je opracování potřebné pro současné splnění požadavku inaktivace mikroflóry a co nejmenšího poškození smyslových a výživových parametrů jakosti výrobku.

3. Determination of the thermal resistance characteristics
When?
to calculate of heat treatment for a new product
to determine of the influence of different environmental factors in heat resistance of microorganisms
to study of mechanisms of the heat resistance
Termoinaktivační parametry se studují zejména při vývoji pasteračních nebo sterilačních režimů, v případě stanovování vlivu vnějších faktorů na odolné původce kažení, a nebo při studiu mechanismu tepelné rezistence.

4. Technique of determination of thermal resistance
Choise of target microorganism.
Determination of
D- and z- value.
Heating of inoculated medium for varying lenghts of time at a series of different temperatures.
Determination of the number of surviving microorganisms.
Nejprve je stanoven cílový mikroorganismus.- patogen nebo tepelně rezistentní mikrob způsobující kažení konzervované potraviny
obvykle doporučované patogeny - Salmonella nebo E. coli, i termorezistentní plísně, apod.
pokud je vybrán jiný mikroorganismus pro testování než patogenní, měl by mít vyšší tep. rezistenci než nejvíce termorezistentní patogen, který může přežít a růst v produktu i po tepelném ošetření.
2.Dále je inokulováno vybrané medium. Mediem, které je očkováno, může být buď přímo potravina nebo nějaké modelové medium, např. fosfátový pufr?. Je lépe použít jako medium pro ohřev potravinu, protože měříme parametry mikroorganismu v reálných podmínkách. Chemické složení media pro ohřev do značné míry ovlivňuje termorezistenci mikroorganismu (pH, koncentrace NaCl, atd.). Zaočkované medium je zahříváno při stanovených teplotách v různých intervalech.
3.Po stanovení počtu mikroorganismů, které přežili záhřev, je sestrojena přímka přežití mikroorganismů vynesením logaritmu počtu přežívajících mikroorganismů proti době záhřevu při konstantní teplotě. Z této křivky lze odečíst významný parametr, hodnotu D, která označuje dobu potřebnou k tomu, aby aplikovaná teplota (konstantní) snížila četnost živých mikroorganismů obsažených v zahřívané potravině právě o 1 řád (tedy o 90 %, tj. na 1/10). Vyneseme-li hodnoty logaritmů D proti teplotě získáme termoinaktivační neboli letalitní přímku D-t. Přímky D-t téhož mikrobiálního druhu nebo skupiny v téže nebo podobné potravině mají stejnou směrnici, označovanou jako hodnota z. Hodnota z je změna teploty vedoucí k desetinásobnému snížení hodnoty D.Hodnota D i z se využívají při hodnocení účinnosti a optimalizaci tepelného procesu.
Construction of microbial survival curve.

5. Criteria for selection of the method
to attain very fast heating rates of inoculated media
to take into account the effect on the heat resistance of any influencing factor
composition of medium
food product
model medium (e.g. phosphate buffer) pH
concentration of NaCl
to be precise, accurate and easy to perform
not to be time consuming, so as to obtain an appropriate number of data for statistical analysis
Dobrá metoda pro měření termoinaktivačních parametrů by měla splňovat následující požadavky:
Požadovaná teplota zaočkovaného media musí být dosažena rychle, aby se eliminovalo teplotní zpoždění. Požadavek rychlého dosažení teploty je významný zejména při vysokých teplotách, kdy jsou doby tepelného ošetření velmi krátké a hodnoty D velmi nízké. Jak je vidět z obrázků, je velmi důležité, v jaké nádobě je prováděno tepelné ošetření zaočkovaného vzorku. Čím rychleji je dosaženo požadované teploty vzorku a tedy čím menší je teplotní zpoždění při záhřevu, tím přesněji stanovíme termoinaktivační parametry.
Metoda musí uvažovat vliv vnějších faktorů na termorezistenci. Termorezistenci mikroorganismů ovlivňuje chemické složení media, ve kterém je inokulum tepelně ošetřováno. Proto je třeba zvolit jako medium buď přímo potravinu nebo modelové medium velmi dobře simulující podmínky v potravině. Dále je dobré, pokud metoda umožňuje měření pH a teploty v průběhu měření.

6. Heat resistance determination methods
TDT (Thermal death time) tube method
TDT can method
“Tank” method
3–neck flask method
Unsealed TDT tube method
Capillary tube method
Thermoresistometer method
Metod pro stanovení termoinaktivace mikroorganismů je mnoho. Jsou stále modifikovány a zdokonalovány.
Jednotlivé metody se liší tím, jak je inokulované medium zahříváno ( v zatavených skleněných ampulkách, tubičkách, kapilárách, v malých kovových plechovkách, v tříhrdlé baňce, tanku, nezatavené trubičkách, v termorezistometru nebo v kovových kapilárách atd.).
Metody se dále liší omezením teplotního rozsahu, ve kterém může být metoda použita související s teplotním zpožděním při ohřevu a ochlazení. Metody s velkým teplotní zpožděním lze využít jen pro teploty nižší než 100 °C. V současné době se nejvíce pro stanovení termorezistence používá kapilární metoda a termorezistometr.

7. Thermoresistometer. (Dyrlæge H. Riemann, 1954)
Heating medium is heated and agitated in a stainless steel vessel (8,5 x 12 cm).
Automatic injection of inoculum to heating medium.
Automatic sampling to revolving fractions collector.
High speed of operation
(52 samples/s).
Termorezistometr je automatické zařízení poprvé zkonstruované v roce 1948 (Stumbo). Přístroj byl dále modifikován a vylepšován. Dnes se používá nejčastěji model termorezistometru z roku 1993 (Condón).
Vzorek je zahříván a míchán v nerezové nádobě (8,5 x 12 cm). Inokulum je do vzorku vstřokováno automaticky a stejně tak jsou automaticky odebírány vzorky v nastavených časových intervalech a zachycovány otočným sběračem frakcí. Přístroj pracuje vysokou rychlostí (52 vzorků/s).
Thermoresistometer. (Dyrlæge H. Riemann, 1954)

8. Thermoresistometer Advantages Disadvantages High initial cost.
Heat resistance determination at temperatures from pasteurization to UHT (57-150°C).
Rapid heating and cooling of samples.
Constant monitoring of pH and precise control of temperature.
Determination of very low D-values.
Labor saving, simplicity of operation, low upkeep.
Disadvantages
High initial cost.
Using only for liquid suspension and homogenates.
Termorezistometr má řadu výhod. Díky automatickému režimu lze měřit velmi přesně i malé hodnoty D při vysokých teplotách, protože se eliminují zpoždění způsobená ruční manipulací se vzorkem. Obrovskou nevýhodou je vysoká pořizovací cena a tedy značná nedostupnost.

9. Capillary method Stern a Proctor (1953)
inoculated medium was heated in sealed thin-walled glass capillary tube.
Today – stainless steel capillary → labor saving at sealing and opening of glass capillary.
Kapilární metoda se používá od roku 1953, kdy poprvé sestrojil Stern a Proctor (1953) přístroj, kde byl vzorek zahříván ve skleněné kapiláře.
Později byl přístroj vybaven dvěma pneumatickými zvedáky pro rychlý transfér kapilár z horké do chladicí lázně. Dnes se používají spíše kapiláry z nerezové oceli. Tím se sníží pracnosti při zatavování a otevírání skleněných kapilár.
Kapilární metoda
VÝHODY
Dobrá dostupnost
Měření v širokém rozsahu teplot (do 140°C)
Rychlý přestup tepla při ohřevu a ochlazení
Podstatně nižší pořizovací náklady než u termorezistometru
Jednoduchost konstrukce a obsluhy
NEVÝHODY
Větší pracnost
Nelze použít pro příliš viskózní produkty

10. Capillary method vs. Thermoresistometer
essentially lower initial cost
higher time consumption
not used for too viscous products
Thermoresistometer
obtaining more data during short time
higher precision
determination of very low D-value
Na grafu jsou porovnány výsledky získané kapilární metodou a pomocí termorezistometru( ▲ termorezistometr, ○ kapilární metoda). Mezi výsledky získanými těmito dvěma metodami není statisticky významný rozdíl. Kapilární metoda je však pracnější. Pomocí termorezistometru byly získány výsledky během 5 hod. a pomocí kapilární metody za 20 hod. práce. Pomocí termorezistometru lze získat i velmi nízké hodnoty D při vysokých teplotách. Omezení použití pro příliš viskózní produkty platí do jisté míry u obou metod.
▲ thermoresistometer
○ capillary tube

11. Conclusion
Capillary tube method should be sufficiently accurate and reasonable at temperature below 120 °C.
This method is tested in our laboratory.
This method means improvement in comparison with methods used in our laboratory till now.
Závěrem lze říci, že kapilární metoda je při teplotách do 120 °C dostatečně přesnou a dostupnou metodou. Metoda se v současné době zavádí a testuje v naší laboratoři.
Budeme ověřovat a zjišťovat možnosti měření termorezistentních parametrů při vysokých teplotách, kde je potřeba velká preciznost a přesnost, zejména při udržování teploty na přesně stanovené hodnotě, dále i přesnost dodržování doby působení tepla, což je při vysokých teplotách, kdy je doba působení tepla velmi krátká, problém.
Při kapilární metodě vznikají jisté nepřesnosti při ruční manipulaci se vzorky a je zapotřebí určitá manuální zručnost a zaškolení pracovníků, kteří touto metodou měří. V případě termorezistometru je zde časovač, který přesně hlídá doby působení tepla a automaticky odebírá vzorek pro mikrobiologické vyšetření počtu přežívajících mikroorganismů.
Budeme se snažit také ověřovat výsledky již naměřené pomocí doposud používaných metod.
Kapilární metoda znamená velké zpřesnění při měření termoinaktivačních parametrů v porovnání s metodami používanými v naší laboratoři doposud.