1. 双荧光素酶报告基因介绍 学生：刘艳玲 导师：陈小平研究员 日期： 2017.11.21

2. 双荧光素酶报告基因实验介绍 简介 双荧光素酶报告基因实验是常用的 检测 miRNA 与靶基因结合、转录调 控和启动子活性的实验。 荧光素酶是生物体内催化荧光素或 脂肪醛氧化发光的一类酶的总称， 来自于自然界能够发光的生物，例 如萤火虫等。 海肾素荧光蛋白作为内参来去除组 间的转染效率差异。 荧光素 +O 2 氧化荧光素 + 生物荧光 荧光素酶 优点：灵敏、高效、快速

3. 双荧光素酶报告基因实验介绍 1. 验证 miRNA 与靶基因结合 miRNA 通过和靶基因 3’UTR 结合后抑制靶基因的翻译，从 而导致萤火虫荧光素发光值下降，当结合位点被突变后荧 光值回复上升，证明 miRNA 确实通过结合位点调控靶基因。 实验步骤包含两部分：质粒转染细胞和报告基因检测。 常用载体 质粒 野生型质粒：萤火虫荧光素酶 3’UTR 插入目的序列的 载体。不一定要插入靶基因的 3’UTR 全长。可以只插 入包括 miRNA 结合位点前后 200bp 左右的序列。 突变型质粒：萤火虫荧光素酶 3’UTR 插入 miRNA 结合 位点突变的序列载体。

4. 双荧光素酶报告基因实验介绍 细胞 验证分子间的相互作用，细胞只是一个媒介或载体。通常选用 293T ， HEK293 等工具细胞。优 点：易于转染、转染效率高。 实验组 序号 实验组名称 即各实验组共转质 粒说明 实验组 详细说明 实验组 1 3‘UTR-NC + miRNA-NC 靶基因 3‘UTR 阴性对照质粒分别与 miRNA 极其对照 质粒共转，作为阴性对照及整个实验体系对照 实验组 2 3‘UTR-NC +miRNA 实验组 3 3‘UTR-WT +miRNA-NC 野生型靶基因 3‘UTR 质粒分别与 miRNA 极其对照质 粒共转，是体系中的目的实验组 实验组 4 3‘UTR-WT +miRNA 实验组 5 3‘UTR-Mut +miRNA-NC 将靶基因 3‘UTR 靶位点序列进行突变，将该突变质 粒分别与 miRNA 极其对照质粒共转，与实验组 4 进 行比较以便进一步验证 实验组 6 3‘UTR-Mut +miRNA Dig Dis Sci. 2017 Nov 2 经典分组

5. 双荧光素酶报告基因实验介绍 2. 验证转录因子与启动子特异序列结合 构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒；将要检 测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染 293 细胞或其它相关的细胞系。如果此转 录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的 作用强度成正比。 3. 启动子活性检测 主要是通过对启动子进行截短。

6. 双荧光素酶报告基因实验介绍 报告基因质 粒构建 质粒转化 质粒 DNA 提取 转染 报告基因活 性检测 报告基因活性检测原理：加入荧光素酶检测试剂Ⅱ （ LAR Ⅱ）时产生萤火虫荧光信号，先测量萤火虫 荧光素酶报告基因。定量萤火虫荧光强度后，再 在同意样品中加入 Stop ＆ Glo® 试剂，将上述暗影 淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，同时进行 第二次测量。 注意事项： Stop ＆ Glo® 试剂现配现用并先在 37 ℃中平衡至室温（ 15-30min ）再稀释后使用； LAR Ⅱ不可反复冻融，一次性配好后分装并在 - 20 ℃避光保存，并在使用前拿出平衡至室温后使 用。 LAR Ⅱ可在 -20 ℃稳定一个月， -70 ℃温度一年。 细胞漂洗用 PBS 尽量吸尽， PLB 裂解液需要充分 裂解细胞； 测定过程尽量避光进行。吹打过程中尽量不产生 气泡。