1. Enzyme Phosphorylation
Aulanni’am
Biochemistry Laboratory
Chemistry Department
Brawijaya University
Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10

2. Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10
Phosphorylation
Fischer, Kreb (1978)
Ser Thr Tyr (His) P
Protein OH
Kinase
phosphorylation
Conformational
Change
dephosphorylastion
Phosphatase
Glycogen phosphorylase b
Glycogen phosphorylase a
Inactive Active
為何 GP 經過磷酸化，或者與效應物分子結合後，會改變其活性？ 主要原因是因為 GP 可因磷酸化等修飾而改變其分子構形。
GP 的分子構形有兩種形式，其一是較為鬆散的 R 型，有較大的活性；另一為較緊張的 T 型，活性較低。 當 GP 被磷酸化或與小分子結合，就會在這兩種構型之間轉換，因而改變其活性。 蛋白質是利用其胺基酸序列中 Ser, Thr 或 Tyr 上面的 -OH 基團進行磷酸化，經磷酸化後這些胺基酸基團變成帶有極強的負電性，會造成與同一分子上其他帶正電基團間的吸引，因此而牽動分子改變構形。後來又發現，His 上的 imidazole 基團也會被磷酸化。
蛋白質的磷酸化及去磷酸化是相當普遍的現象，但加上磷酸後的活性是上升或下降，則隨蛋白質或細胞不同而異。磷酸化可說是蛋白質補足其二十種基本胺基酸基團太弱的方法，使得蛋白質有較強的基團可以應用；但比這還高明的是，利用後來才修飾上去的磷酸化，也可以用酵素去除之，結果變成一種轉換自如的修飾方式，機動性地調節酵素活性，可稱為『磷酸化-去磷酸化循環』控制。
Active Inactive
Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10

3. Regulation of Blood Sugar
Cori & Cori (1947)
Signal Transduction
Decrease
Tyrosine-kinase-linked receptor
Insulin
High blood sugar
Glycogen
synthase
Liver
Pancreas
Blood
Hormone
Glycogen
Glucose
Glycogen
phosphorylase
Increase
Low blood sugar
Glucagon
GTP-protein-linked receptor
血糖 太高或太低對人體都有不好的影響，因此體內有極為複雜的血糖調節系統，主角是合成肝糖的肝糖合成脢 (glycogen synthase, GS)，以及降解肝糖以生成葡萄糖的肝糖磷解脢 (glycogen phosphorylase, GP)。 此二酵素分別受到荷爾蒙胰島素 (insulin) 及胰增糖素 (glucagon) 的影響，人體便可利用控制荷爾蒙的濃度來調節血糖濃度。
這兩種荷爾蒙分子到達目標細胞時，細胞膜上有此荷爾蒙的接受體，當兩者接合之後信息便可傳入細胞內，引發酵素活性，進行所需要的糖類代謝。 這些信息是如何傳導給最終的酵素 GS 及 GP？ 這即是最近極為蓬勃的信息傳導，以及典型的酵素調控機制。以下就以肝糖磷解脢為主要對象及實例，說明酵素如何以磷酸化、信息傳導分子以及迴饋控制的方式，進行其活性的調節。
肝糖磷解脢具有以上各種調控機制，很少有酵素如此密集地被調控著，因為肝糖磷解脢在糖類的利用實在是太重要。 以下我們先瞭解肝糖磷解脢的分子構造及生化性質。
Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10

4. Rapid Response to Blood Sugar Concentration
Glycogen phosphorylase
Glycogen synthase
Enzyme activity
葡萄糖
當人體 血中的葡萄糖濃度上升，在短短數分鐘內，至少有兩種酵素的血中濃度會產生劇烈改變。肝糖磷解脢濃度很快下降，而肝糖合成脢急劇上升，都在數分鐘內完成。由此一觀察，有兩件值得注意的推論或事實。
(1) 血液中的葡萄糖濃度是一種訊息 (signal)，可快速誘發某些反應。
(2) 上述的兩種酵素在數分鐘內消長，不太可能是由基因的開關來調控，較可能經由對蛋白質的直接修飾來進行活性控制。
這整件事情，就是前一頁所說明的荷爾蒙調控系統所導致，後者並誘發其目標細胞的信息傳導反應。
Time (min)
Very rapidly →
Not controlled in gene level
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5. n n-1 R T + + GP kinase Glycogen Phosphorylase, GP Protein kinase A
Glc-1-P → Glc-6-P → Glycolysis
Glycogen P n
n-1
Glycogen
phosphorylase a* P
Glucose (-)
Caffeine (-)
Phosphorylase R T
Phosphatase P
Protein
kinase A + GP
kinase
ATP
cAMP
6.2
6.4 +
AMP (+)
ATP (-)
Glc-6-P (-)
肝糖磷解脢 (GP) 可以對肝糖進行磷解反應，由肝糖長鏈的端點開始，把葡萄糖一個個切下來，並且加上磷酸成為 Glc-1-P，後者可以進入糖解作用以產生能量。
平常 GP 是以較不活躍的 b 型存在著，要用其專用的激脢 (GP kinase) 進行磷酸化，才成為具有活性的 a 型。而此激脢要受到另一種激脢 (protein kinase A, PKA) 的磷酸化才會有活性，才能去磷酸化 GP；而 PKA 又要受到 cAMP 的活化後，才有活性。
cAMP 是一個重要的信息傳導分子，當荷爾蒙 glucagon 與目標細胞接合後，就在胞膜的接受體上誘發胞膜內側的 G protein，後者會活化 ATP cyclase 使得 ATP 產生 cAMP。因此這一條路徑就把外界荷爾蒙所傳來的信息，經由 cAMP 傳到 PKA，再傳到 GP kinase 後，即可活化 GP 開始執行細胞任務，把肝糖分解成單糖，以供細胞或人體所需。
上述磷酸化只是 GP 的一種調節方式而已，是屬於共價鍵式的可逆修飾，因為磷酸化後的 GP 也可以用磷酸脢 (phosphatase) 去除磷酸，以恢復其非活性型 b。另外，GP 活性也受到其代謝物的影響，例如當血糖中有太多的單糖或能量分子，顯示不需要再水解肝糖；此單糖或能量分子 (如 Glc-6-P, ATP) 可以直接與 GP 結合，以迅速降低其活性。
因此，GP 除了磷酸化之外，其活性還可以受到 AMP, Glc-6-P 等小分子所調節；這些小分子都是結合在其活性區以外的地方，是有異於活性區的位置，因此特稱之為異位脢 。
Glycogen
phosphorylase b
(inactive)
6.3
Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10
Juang RH (2004) BCbasics

6. cAMP Controls Protein Kinase A Activity
Regulatory
subunits A
Active kinase A
cAMP A A C R C A R
Catalytic
subunits
Nucleus
CREB
Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p. 857, 858
Activation C
蛋白質 激脢中的 protein kinase A (PKA) 可以對較廣泛的蛋白質進行磷酸化反應，其本身的活性又被 cAMP 所活化。在某些細胞中，PKA 會進入細胞核中，並且磷酸化促進基因轉錄的蛋白質 (如上面的 CRE-binding protein, CREB)，啟動某些基因。
PKA 共有四個次體，含有兩個催化次體 (C) 及兩個調節次體 (R)，R 接受 cAMP 後即釋放出具有活性的催化次體。 P
Gene
expression
CREB
DNA
Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10

7. cAMP Is the Second Messenger
Sutherland (1971)
Glucagon
Adenylate cyclase
Receptor
Cyclase
G protein
G protein
Cascade
cAMP
ATP A
Cyclic AMP (second messenger)
Protein Kinase A P
GP Kinase
GP kinase P
GP1 a
GP b
因此 肝糖磷解脢的活性調控交織成一複雜的梯瀑結構 (如上圖)，細胞內由 cAMP 開始傳訊，最後到達肝糖磷解脢，達成肝糖分解利用的目標。 但是細胞外的信息是如何傳遞進來的？以荷爾蒙 glucagon 為例，當 glucagon 找到表面有適當 receptor 的細胞，並且與之結合，接著在細胞膜上發生一連串的反應： 首先 receptor 接受荷爾蒙後，誘發 G protein 的活化 (詳細機制在下一張圖)，G protein 接著活化 adenylate cyclase (結環脢)，後者可以把 ATP 結環成為 cAMP，再往下的故事你大概都知道了。
這裡有一個重點，就是上述細胞的 receptor。 Receptor 就好像一家店的招牌，有咖啡店招牌的就可以喝咖啡，有牛肉麵招牌的就吃麵。細胞也是一樣，有各種不同功能的細胞，而其表面的 receptor 可以告知荷爾蒙正確的信息。因此，兩者的接合也是非常專一性的，有點像鑰匙與門鎖一樣，什麼樣的鑰匙開其對應的門鎖，不能搞錯。有了這樣的機制，如 glucagon 這般的荷爾蒙，才能找到正確的對象，把信息傳到，並且引起正確的反應。
Inactive GP
Juang RH (2004) BCbasics
Active
Glycogen
Glc-1-P
Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10

8. Receptors on Cell Membrane
Gilman, Rodbell (1994)
G-protein-linked Receptor
Glucagon
Adenylate cyclase a
GTP
+ Signal a
GTP a
GDP b g b
G protein a g
GDP
-GDP
+GTP A
Glycogen breadkdown
The third group:
Ion-channel-linked Receptor
Enzyme-linked Receptor
Insulin a
+ Signal
Activation
Glycogen
Synthase P
kinase b P P
Protein
Phosphatase
細胞膜上 到底如何傳遞信息？ 其方式實在非常多，一般依照 receptor 種類，可整理出三大類主要模式：
(1) G-protein-linked Receptor: Receptor 與 G protein 連結後活化之，G protein 本身是 GTP 結合蛋白，與 GTP 結合後可以活化 adenylate cyclase，後者催化 ATP 成為 cAMP。
(2) Enzyme-linked Receptor: Receptor 連結著激脢 (如 tyrosine kinase)，後者自我磷酸化活化自己，也吸引來一些酵素 (如含有 SH2 domain 的磷酸脢) 並且活化之，然後繼續下游的催化路徑。
(3) Ion-channel-linked Receptor: 與細胞膜上的離子主動運輸有關。
SH2
domain
active P
Juang RH (2004) BCbasics
Glycogen
Synthase
Glycogen synthesis
Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10

9. Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10
Phosphatase
GP kinase
GP a
GP b P
Glycogen synthase
Glucagon
Glycogen P
PKA A
Protein phosphatase-1 P
Protein phosphatase inhibitor-1
細胞 表面的接受體 receptor 非常重要，因為它標明該細胞內的活動為何，以接受正確的外來信息，做出正確的生理反應。以肝糖代謝的細胞為例，可以接受 glucagon 的細胞，就會引發細胞內一連串反應，產生 cAMP 活化 PKA，此 PKA 接著對幾種酵素進行磷酸化反應，磷酸化的結果使某些酵素活性上升 (如 GP kinase, protein phosphatase inhibitor)，但也使某些酵素活性下降 (如 glycogen synthase, protein phosphatase)。其最後結果，就是使得肝糖的合成降低，增加肝糖降解，以供身體利用葡萄糖產生能量。
上圖的 protein phosphatase 會去除磷酸化 (見上圖彎曲向上點線箭頭)，因而降低肝糖磷解脢的活性，並且增加肝糖合成脢活性，與 glucagon 所要的結果相反，因此在這個細胞中被抑制 (雖然也是被磷酸化，但磷酸化後活性降低)。反過來看，此一酵素的 inhibitor 則被活化，進一步控制了 protein phosphatase 的活性。
active P
Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10
inactive
Adapted from Kleinsmith & Kish (1995) Principles of Cell and Molecular Biology (2e) p.217

10. Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10
Signal Transduction
各種荷爾蒙
Hormone Signal
Receptor
各種接受體 G
Transducer
Effector Enzyme
Effector
Effect
不同的 G-protein
Cyclase
各種關鍵酵素
各種信息分子
信息傳導 有一定的傳導路線，那一個分子傳給那一個，都有其專一性； 例如 cyclase 專一性地催化 cAMP 大量產生。本圖把這種路徑分成幾個層次，最後到達 effector cAMP，cAMP 會在細胞內產生特定效應，以執行所負的生理功能，也稱為 second messenger。
雖然每一個細胞內的信息傳導，都有相當的專一性，但不同的細胞間，其傳導路線卻有很大的彈性，可以把上述各層次的傳導單位，做各種不同的組合。也就是說，每一層都有可能許多選擇，細胞可以選擇某一傳導物質，而且可以有不同的效應。 例如，同樣是 kinase 的磷酸化作用，但有些蛋白質被磷酸化後是提高活性，有些剛好相反，端視該細胞內有的是何種蛋白質傳導分子。
因此，在信息傳導的設計上，細胞不但考慮到其工作效率，利用酵素的放大作用來放大信息 (amplification)；也考慮到整個細胞的經濟效益，挑選預鑄好的各種傳導分子，以便彈性地組合成各種不同的傳導路線，以適應細胞的種種不同需要 (flexibility)。
各種效應
Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10
Juang RH (2004) BCbasics

11. Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10
to be continued..
Aulani "Biokimia Enzim" Presentasi 10