1. Hutchinson Gilford Progeria Syndrome and Lentivector
Corso di Terapia Genica anno
Hutchinson Gilford Progeria Syndrome and Lentivector
Group members:
Alessandro Angerilli
Angela Di Bello
Elena Grossi
Marta Marzullo

2. Hutchinson-Gilford disease: Clinical Features
Premature development of “segmental” features recalling aging
Severe growth retardation
Skeletal alteration
Amyotrophy, lipodystrophy and skin atrophy
Alopecia
Extremely severe atherosclerosis
The mean age at diagnosis is 2.9 years, while death occurs at a mean age of 13.5 years
La progeria di Hutchinson-Gilford è stata descritta per la prima volta da Jonathan Hutchinson nel 1886 e successivamente fu caratterizzata da Hastings Gilford nel 1897, in maniera indipendente dal lavoro di Hutchinson. Tale sindrome appertiene ad un gruppo di malattie denominate laminopatie, causate da mutazioni nel gene LMNA che codifica per la lamina A e C. Si manifestano con fenotipi clinici molto diversi e negli ultimi 10 anni sono state individuate 15 patologie associate a mutazioni del gene LMNA.
La progeria di Hutchinson Gilford è una sindrome segmentale ad insorgenza precoce che presenta diverse caratteristiche del processo di invecchiamento. Fra i segni maggiori si riscontra un forte ritardo nella crescita, accompagnato da diverse alterazioni nello sviluppo delle ossa e della muscolatura. In particolare l’amiotrofia comporta una diminuzione, fino alla scomparsa, della massa muscolare, dovuta ad una riduzione delle fibrocellule muscolari e dell’energia contrattile. È molto frequente la lipodistrofia, che si manifesta tramite una ridistribuzione dei lipidi nel corpo con una mancanza di tessuto adiposo in alcune parti e un eccesso in altre, soprattutto nelle guance o sulla parte posteriore del collo, accompagnata da atrofia cutanea dovuta ad un assottigliamento più o meno marcato della cute. I pazienti affetti da progeria presentano alopecia e aterosclerosi, una malattia degenerativa che colpisce le arterie di medio e grosso calibro. L'aterosclerosi è infatti causa di patologie molto gravi come l’infarto, l’ictus e le cardiopatie, che rappresentano le maggiori cause di morte nei pazienti affetti da tale sindrome.

3. Molecular characterization
In 2003 the disease's genetic basis was identified: HGPS is caused by point mutations that increase utilization of an alternative splice donor site in exon 11 of LMNA (the gene encoding lamin C and prelamin A)
Chromosome 1 (1p22)
Nel 2003, tramite il lavoro svolto da due diversi gruppi di ricerca, si è arrivati a definire la causa della progeria: una mutazione sinonima nell’esone 11 che comporta la transizione da citosina a timina a livello genomico, senza alterare la sequenza amminoacidica (gly608gly). Questa mutazione, ed altre identificate successivamente, portano all’attivazione di un sito di splicing donatore criptico. In condizioni normali, il gene LMNA codifica due diverse isoforme, la lamina A e C, tramite un evento di splicing alternativo. Le lamine A e C sono infatti identiche per i primi 566 amminoacidi, ma differiscono nella porzione carbossi-terminale. Nei pazienti HGPS, l’uso del sito criptico di splicing, comporta la perdita di circa 150 bp nell’mRNA, con la formazione di una proteina tronca caratterizzata dalla perdita di circa 50 aa, definita progerina.
NORMAL SEQUENCE
C1824T
G G T G G G C
G G T G G G T

4. Prelamin A vs Progerin processing
HA- lamin A
HA- progerin
anti-HA
La lamina A deriva dal precursore prelamina A, caratterizzata all’estremità C terminale dalla presenza di un segnale -CAAX, soggetto a modificazioni post-traduzionali. Queste iniziano con la farnesilazione della cisteina da parte di una farnesiltransferasi citosolica. In seguito alla farnesilazione, gli ultimi tre
aminoacidi della prelamina A (cioe’ i residui -AAX del motivo CAAX) vengono tagliati da endoproteasi di membrana, Zmpste24 e RCE1, localizzate nel reticolo endoplasmico rugoso. La farnesilcisteina rimasta, viene metilata ad opera di una metiltransferasi ICMT. Ognuna delle modificazioni del motivo CAAX aumenta la idrofobicita’ del tratto C-terminale della prelamina A, rendendolo adatto ad ancorarsi alla membrana nucleare interna. L’ultima modificazione consiste nel taglio degli ultimi 15 amminoacidi della prelamina A, ad opera della stessa endoproteasi Zmpste24, originando cosi’ la lamina A matura. Le mutazioni che si verificano nel gene LMNA, portano alla formazione di una proteina tronca nelle cellule HGPS. Tale proteina non presenta il secondo sito di taglio dell’endonucleasi Zmpste24 a causa della perdita di circa 50 aa. Il processamento post-traduzionale produce una proteina, definita progerina, che rimane farnesilata e si accumula nella membrana del ER.
La lamina A è una proteina fibrosa ( Da) le cui molecole si uniscono fra loro formando filamenti. L’associazione di diverse lamine porta alla formazione di una struttura di sostegno denominata lamina nucleare, legata alla membrana interna dell’involucro nucleare. Oltre alla funzione di sostegno, le lamine forniscono siti di ancoraggio per la cromatina e si pensa possano avere anche funzione di regolazione sulla sua attività (le zone adese sono inattive, ovvero compongono l’eterocromatina). Durante la mitosi, le lamine vengono depolimerizzate in seguito a fosforilazione, un processo necessario affinché il nucleo possa dissolversi e permettere il proseguimento della mitosi. Inoltre tali proteine svolgono un ruolo importante nel processo di riparazione del DNA, tramite l’attivazione di p53. Nelle cellule HGPS, l’accumulo della progerina causa un’alterazione della struttura dell’involucro nucleare e dell’eterocromatina. In queste cellule si verifica una overespressione di molti geni target di p53, con il conseguente instaurarsi di un fenotipo senescente

5. Gene therapy approaches
Morpholino oligonucleotides
FTI
GFP
ex9
ex10
ex11
ex12 wt
mut
GGC>GGT
Finora sono stati sperimentati due diversi approcci di terapia genica.
La prima strategia si basa sull'uso del morpholino, un oligonucleotide antisenso che si appaia alla sequenza mutata dell'esone 11, mascherando il sito di splicing criptico. L’uso di questo oligonucleotide riduce i livelli di progerina presente nella cellula, corregge le alterazioni tipiche dell’involucro nucleare e ristabilisce l’espressione dei geni deregolati nella malattia. Tuttavia, in vivo, questa strategia mostra delle limitazioni dovute alle piccole dimensioni della sequenza target presente nell’mRNA, su cui deve appaiarsi l’oligonucleotide antisenso.
Rappresentazione schematica del minigene LMNA wild type e del minigene con una mutazione nell’esone 11. Le linee tratteggiate mostrano gli eventi di splicing predetti, le frecce rappresentano i primer usati per l’amplificazione e la barra nera indica la posizione dell’oligonucleotide exo11. La regione genomica a monte dell’esone 11 è fusa al cDNA della GFP.
La seconda sfrutta un inibitore della farnesil-transferasi, per bloccare la farnesilazione della progerina. Infatti la forma non farnesilata di questo precursore aberrante è solubile: l'uso degli FTI impedisce, quindi, l'accumulo di fibre di progerina nelle membrane. Tuttavia, gli FTI agiscono indiscriminatamente sulla farnesilazione di tutte le proteine. Un esempio ben caratterizzato è il processamento post-traduzionale della proteina ras, coinvolta nella trasduzione del segnale all’interno delle cellule. Tale processamento prevede la prenilazione di Ras , cioè il trasferimento di un gruppo isoprenoide farnesilico (C15) dal farnesildifosfato (FPP) all'atomo di zolfo della cisteina del tertrapeptide CAAX carbossiterminale di ras. L'enzima necessario per questo processo è la farnesil transferasi. Questo esempio mostra l'essenzialità di tale enzima. Tuttavia l'unico trial clinico attualmente in corso per la HGPS è basato sull'uso dei FTIs.
Finora sono stati sperimentati due diversi approcci di terapia genica.
La prima strategia si basa sull'uso del morpholino, un oligonucleotide antisenso che si appaia alla sequenza mutata dell'esone 11, mascherando il sito di splicing criptico. L’uso di questo oligonucleotide riduce i livelli di progerina presente nella cellula, corregge le alterazioni tipiche dell’involucro nucleare e ristabilisce l’espressione dei geni deregolati nella malattia. Tuttavia, in vivo, questa strategia mostra delle limitazioni dovute alle piccole dimensioni della sequenza target presente nell’mRNA, su cui deve appaiarsi l’oligonucleotide antisenso.
Rappresentazione schematica del minigene LMNA wild type e del minigene con una mutazione nell’esone 11. Le linee tratteggiate mostrano gli eventi di splicing predetti, le frecce rappresentano i primer usati per l’amplificazione e la barra nera indica la posizione dell’oligonucleotide exo11. La regione genomica a monte dell’esone 11 è fusa al cDNA della GFP.
La seconda sfrutta un inibitore della farnesil-transferasi, per bloccare la farnesilazione della progerina. Infatti la forma non farnesilata di questo precursore aberrante è solubile: l'uso degli FTI impedisce, quindi, l'accumulo di fibre di progerina nelle membrane. Tuttavia, gli FTI agiscono indiscriminatamente sulla farnesilazione di tutte le proteine. Un esempio ben caratterizzato è il processamento post-traduzionale della proteina ras, coinvolta nella trasduzione del segnale all’interno delle cellule. Tale processamento prevede la prenilazione di Ras , cioè il trasferimento di un gruppo isoprenoide farnesilico (C15) dal farnesildifosfato (FPP) all'atomo di zolfo della cisteina del tertrapeptide CAAX carbossiterminale di ras. L'enzima necessario per questo processo è la farnesil transferasi. Questo esempio mostra l'essenzialità di tale enzima. Tuttavia l'unico trial clinico attualmente in corso per la HGPS è basato sull'uso dei FTIs.
Clinical Trial in progress ( )

6. Goals: Avoid the production of progerin caused by aberrant splicing
Recovery of Lamin A isoform
Rescue of the wild type phenotype
New gene therapy approach based on TALENs
(Transcriptional Activator Like Effectors Nucleases)
focused on the classical mutation occurring in HGPS: C1824T

7. Naturally occurring TALE:
Recognition code:
[one di-residue – one nt]
Gli attivatori trascrizionali TALE (transcriptional activator-like effector) sono una classe di DNABP recentemente caratterizzate prodotte da patogeni, come Xanthomonas: questi batteri infettano in particolare le piante e, grazie ai TALE, sono in grado di regolare la trascrizione della cellula vegetale.
Infatti i TALE agiscono riconoscendo una sequenza consensus nel genoma dell'ospite e inducendone la trascrizione. Tale specificità di sequenza è determinata da un dominio di legame al DNA composto da sequenze di AA ripetute in tandem: all'interno di ciascuna ripetizione, in 12°-13° posizione, vi è una coppia di AA polimorfica (RVD - repeat variable di-residues) specifica per il riconoscimento di una singola base. La scoperta che i quattro più comuni RVD corrispondevano ognuno ad una delle 4 basi azotate, ha fornito un “codice”, che ha permesso di creare TALE artificiali, dotati di DNABD specifici per la sequenza di interesse. Questo sistema non è solo un ottimo DNA targeting tool, ma può essere sfruttato per indurre editing genomico: infatti, fondendo al TALE il dominio catalitico di una nucleasi come FokI, si può provocare un DSB, che porta ad un evento di ricombinazione omologa (HDR) o non omologa (NHEJ) con un alto livello di specificità.
Engineered TALEN:

8. CAREFUL TO THE FRAMESHIFT!
Application of TALEN's technology to HPGS disease:
Customization of TALENs to bind sequences flanking the mutated region
TALENs-mediated deletion of a specific three-nucleotide codon containing the mutation
CAREFUL TO THE FRAMESHIFT!
AACACCTGGGGCTGCGGGAACCACCCAGCTCTCATCAACAACACCT
TTGTGGACCCCGACGCCCTTGGTGGGTCGAGAGTAGTTGTTGTGGA
exon 11 - C1824T
E' possibile, quindi, ipotizzare un approccio di terapia genica per la progeria basato sull'uso di TALENs: dotando il TALENs di un DNABD in grado di legare le regioni adiacenti alla mutazione, si potrebbe ottenere una rottura a doppio filamento, che porti all'esclusione dei nucleotidi che formano il sito di splicing criptico:la specificità del riconoscimento (circa una ventina di nt) deve assicurare la delezione di un'intera tripletta, per evitare il frameshift. La delezione della tripletta porterà all'eliminazione di una Glicina: tuttavia, ciò non dovrebbe avere effetti deleteri sulla funzionalità della Lamina A, in quanto tale residuo si trova in una porzione c-terminale (tail), non essenziale alla funzionalità della proteina (dati forniti dal database SWISS-PROT).
The deleted region is part of C-term tail = not essential to protein function!
(SWISS PROT)

9. 3rd Generation Lentivectors:
Lentiviral expression vector Ψ
Lentiviral Packaging plasmids
Nel vettore d'espressione pSMPUW-Neo (CellBioLabs) è stato clonato un inserto contenente
I due TALEN sotto il controllo del promotore inducibile TRE, il gene reporter GFP sotto il controllo di un'altro promoter TRE ed il transattivatore rtTA del sistema Tet- On sotto il controllo del promotore PGK. Il sistema contiene il gene resistenza batterico alla kanamicina ed il gene resistenza eucariotico alla neomicina anch'esso sotto il controllo di un promotore PGK. I plasmidi di packaging sono tipici di un vettore di terza generazione (ViraSafe Lentivirus Packaging System). Il plasmide pCMV trascrive la proteina del nucleocapside dell'Hantavirus sotto il controllo di CMV. Qian and Park hanno dimostrato che lo pseudotipo HTNV induce targeting specifico del muscolo liscio e dell'endotelio con una grande efficenza
Nel vettore d'espressione pSMPUW-Neo (CellBioLabs) è stato clonato un inserto contenente
I due TALEN sotto il controllo del promotore inducibile TRE, il gene reporter GFP sotto il controllo di un'altro promoter TRE ed il transattivatore rtTA del sistema Tet-On sotto il controllo del promotore PGK. Il sistema contiene il gene resistenza batterico alla kanamicina ed il gene resistenza eucariotico alla neomicina anch'esso sotto il controllo di un promotore PGK. I plasmidi di packaging sono tipici di un vettore di terza generazione (ViraSafe Lentivirus Packaging System). Il plasmide pCMV trascrive la proteina del nucleocapside dell'Hantavirus sotto il controllo di CMV. Qian and Park hanno dimostrato che lo pseudotipo HTNV induce targeting specifico del muscolo liscio e dell'endotelio con una grande efficenza.
HTNV

10. In vitro experiments: Check-points:
hESC and iPSC transduction transduced cells Neo Only cells with transgene Tet-On Only GFP-positive
- 1st A control-group trunsduced with an empty lentiviral vector
-2nd Test the presence of TALENs by Western Blot technique.
-3rd Test the removal of the trinucleotide sequence by real time PCR
-4th Verify if differentiated cells express the Lamin A isoform by Western Blot
Check-points:
In HGPS la principale causa di morte nel 90% dei casi è la progressiva occlusione delle arterie che porta alla morte per infarto miocardico intorno ai 13 anni di vita. Il target della terapia genica potrebbe quindi essere la muscolatura liscia (VSMCs).
Per verificare l'effettivo funzionamento del vettore e del costrutto abbiamo deciso di utilizzare le hESC e le iPSC. Inizialmente abbiamo infettato le cellule in coltura con il vettore contenente l'inserto. Un gruppo di controllo è stato infettato col solo vettore vuoto. Quindi abbiamo somministrato deoxiciclina che va ad attivare il sistema tet-On. rtTA è trascritto indipendentemente da un promoter PGK. A seguito dell'induzione una popolazione di cellule risulta GFP-positiva. Selezioniamo I trasformanti con Neomicina il cui gene resistenza è anch'esso controllato da un TRE. Il gruppo di controllo deve risultare GFP-negativo e deve morire con Neomicina. Sopravvivono solo le cellule che sono state correttamente trasformate e risultano essere tutte GFP positive. Quindi in ordine facciamo un Western Blot per verificare la presenza dei TALEN. Successivamente per Real-time-PCR valutiamo l'avvenuta excisione della tripletta target nell'esone 11, ed in ultimo induciamo differenziamento e valutiamo l'effettivo ripristino della produzione di Lamin A .

11. LmnAG608G transgenic mice (atherosclerosis mice)
In vivo experiments:
Choose an efficient animal model
LmnAG608G transgenic mice
(atherosclerosis mice)
Vector injection 8-month mice:
Local carotid arteries injection through “Remedy catheter” and diffused injection through tail vain
4 groups of 5 mice for each mode of injection:
5 individuals LmnAG608G trunsduced with TALEN-HNTV LVs ( 2·107 TU/mouse)
5 individuals WT trunsduced with TALEN-HNTV LVs ( 2·107 TU/mouse)
5 individuals LmnAG608G trunsduced with Adenoviral vectors (1– pfu)
5 individuals WT trunsduced with Adenoviral vectors (1– pfu)
Per lo studio dell'HGPS il miglior sistema modello in vivo è il topo. Sono state create numerose linee mutanti al fine di caratterizzare il gene della lamina A la cui mutazione è responsabile dell'insorgenza dell'HGPS. Esistono topi transgenici con mutazioni nei vari fattori coinvolti nel pathway di aturazione della LaminA e che portano all'accumulo di progerina. Tra questi la linea transgenica LmnAG608G è la migliore per lo studio degli effetti di terapia, in quanto è l'unica che determina anche nel topo un marcato fenotpo difettivo nel sistema cardiovascolare riconducibile all'aterosclerosi umana (tra cui progressiva perdita di VSMC, rottura delle fibre elastiche, assottigliamento dello strato interno e medio dei vasi, accumulo di PG e deposizione di collageno). Il fenotipo patologico nei topi emerge a 5 mesi e diviene severo a 12, non è però letale come invece è nell'uomo in cui insorge intorno ai 13anni.
Le linee LmnA G608G sono state ottenute per ingegnerizzazione degli organismi con BAC contenenti il transgene mutato della LmnA umana con la sostituzione C1824T.
Due gruppi di topi ,uno di topi G608G e uno di topi Wt, composti ciascuno da 5 individui a 8 mesi, sono stati trasdotti con il TALEN HNTV-LV per testare gli effetti della terapia genica in vivo. L'iniezione è stata condotta attraverso due diversi metodi uno diretto nella carotide attraverso catetere Remedy e l'altro diffuso attraverso iniezione nella vena caudale.
Con le stesse metodologie sono stati trasdotti altri due gruppi di topi G608G e WT con un vettore AdV, come controllo per verificare l'efficacia del lentivettore nel tropismo del muscolo liscio.
Come ulteriore controllo per testare gli effetti della terapia si possono usare topi APOE, ovvero topi mutanti per la apolipoproteina E ( responsabile del metabolismo dei lipidi), che se sottoposto a dieta grassa mostrano difetti a livello dei vasi tra cui aterosclerosi. Perciò infettando tali cavie con il vettore lentivirale ingegnerizzato si può dimostrare come l'azione di questo sia a livello della causa del fenotipo, ovvero l'accumulo di progerina,e non dell'effetto, ovvero l'aterosclerosi. I topi WT usati negli esperimenti sono topi C57BL/6J e la quantità di lentivettore usato è circa 2·107 Transduction Unit / topo, mentre la quantità di adenovettore è di circa 1– Plaque Forming Unit
An other control? The same treatment in APOE mice

12. Five weeks after injection
HNTV-LV
In vivo experiments:
Five weeks after injection
GFP expression
Western blot
ELISA
To test vector expression and tropism
- MOLECULAR ANALYSIS
To test and quantify progerin expression level
- MORPHOLOGICAL ANALYSIS
Histological analysis of aortic section and heart
Observation of nuclear architecture
- PATOLOGICAL ANALYSIS I.
α-actin
RFP-VECTOR
merge
AORTIC SECTION
AdV
A 5 settimane dall'infezione dopo anestesia con isofluorano si vanno a sacrificare i topi per vedere l'espressione dei vettori dei vari tessuti (rterie, cuore, polmoni, fegato, ...) e gli effetti sull'accumulo di progerina.
In primis si attua un'analisi molecolare con 1) test di immunofluorescenza per testare l'espressione della GFP e quindi del vettore nei vari tessuti 2) pcr per confermare l'avvenuta insersione del vettore 3) western per avere una stima della variazione dei livelli di progerina dopo il trattamento 4) ELISA per avere una quantificazione statisticamente rilevamente dele variazioni nei livelli progerina.
Dopo l'analisi molecolare si passa ad un'analisi Isto-morfologica per vedere gli effetti della terapia a livello dei tessuti maggiormente colpiti,cioè gli elementi del sistema circolatorio tramite 1)analisi istologica del sezioni aortiche e del cuore tramite trattameno con formaldeide ed invio a laboratori specializzati. 2) analisi dell'architettur nucleare tramite immunocolorazione con AB fluorescenti rivolti verso specifici componenti nucleari.
Infine si attua un'analsi patologica sugli individui trattati per verificare gli effetti della terapia quali immunogenicità, possibile virulenza del vettore, effetti negativi dell' inserzione o dell'espressione della TALEN... in generale per vedere se il topo sta bene!
Nell'immagine sono mostrate sezioni aortiche da individui trattati con HNTV-LV e AdV; nei riquadri A-F si vedono sezioni di topi trattati con HNTV-LV e se ne rileva l'espressione attraverso RFP (rosso Be E) ; in verde sono invece osservabili i filamenti di actina che delimitano il muscolo liscio. Nel merge si vede come actina ed LV co- localizzano. Nei riquadri G-H vi è invece il confronto con sezioni aortiche di topi trattati con l'AdVvector di controllo. Nel riquadro G in verde vi sono i filamenti di actina, nel riquadro H si vede molto basso il segnale RFP del vettore e nel riquadri I il merge. Già dall'analisi per immunofluorescenza si apprezza il basso livello di espressione dell'AdV rispetto all'LV nel muscolo liscio, e i diversi livelli di fluorescenza sono quantificati nell'istogramma sulla destra anche in confronto con unaltro vettore VSV. Le immagni sono ripresa da un lavoro di Zhong Qian et al. Del 2006
Zhong Qian et al. 2006

13. Material and costs: Cloning kit ̴̴̴ 490€ (each clone)
Lentiviral vector ̴̴̴ 416€
TALEN ̴̴̴ 5000€
iPS AND hESC ̴̴̴ 3000 €
C57BL/6J mice(WT) ̴̴ 50 €
Transgenic mouse ̴̴̴ 200€
Molecular analysis (antibodies, reagent prc, western blot...) ̴̴̴ 3000€
ELISA kits ̴̴̴ 4000€
Immuno-histochemical analysis ̴̴̴ €
General patological analysis ̴̴̴ 200€

14. References:
“A-type lamins and Hutchinson-Gilford progeria syndrome: pathogenesis and therapy”. Gonzalez et al., Frontiers in Bioscience S3, , June 1, 2011
“Molecular bases of progeroid syndromes”. Navarro et al., Human Molecular Genetics, 2006, Vol. 15, Review Issue No. 2 R151–R161
“HGPS and related premature aging disorders: From genomic identification to the first therapeutic approaches”, Pereira et al., Mechanisms of Ageing and Development 129 (2008) 449–459
“Reversal of the cellular phenotype in the premature aging disease Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome”, Scaffidi and Misteli, Nat Med April; 11(4): 440–445.
“Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting”; Cermak et al. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12

15. References:
“A Human iPSC Model of Hutchinson Gilford Progeria Reveals Vascular Smooth Muscle and Mesenchymal Stem Cell Defects”; Zhang et al.; Cell Stem Cell Jan 7;8(1): Epub 2010 Dec 23.
“Generic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases”; Hockemeyer D. et al.; Nat Biotechnol Jul 7;29(8):731-4.
“Targeting vascular injury using Hantavirus-pseudotyped lentiviral vectors”.Qian Z et al.;Mol Ther Apr;13(4): Epub 2006 Jan 23
“Progressive vascular smooth muscle cell defects in a mouse model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome”; Varga et al.; Proc Natl Acad Sci U S A Feb 28;103(9):
“Lamin A/C, laminopathies and premature ageing”; Liu and Zhou; Histol Histopathol (2008) 23: