1. Kliničke implikacije nesukladnosti između serumskih vrijednosti anti-Milerovog hormona (AMH) i broja antralnih folikula(AFC)
Miro Šimun Alebić
Odjel za humanu reprodukciju
Klinička bolnica “Merkur”

2. Folikulogeneza inicijalna regrutacija: razvoj do antralnog stadija
ciklička regrutacija: od antralnog stadija do dominantnog folikula
Broekmans et al. Endocrine Reviews 2009, 30(5):465–493
Najprije, kratki podsjetnik na fiziologiju razvoja folikula. To je kontinuirani proces kojeg didaktički možemo podijeliti u dvije faze. U fazi inicijalne regrutacije folikuli se, neovisno o gonadotropinima, razvijaju do antralnog stadija. Od antralnog stadija gonadotropinska stimulacija postaje nužna pa će se uz potporu cirkulirajućih razina gonadotropina, mehanizmima selekcije i dominacije, razviti (najčešće jedan) ovulacijski folikul dok će svi ostali folikuli iz kohorte koja je krenula u regrutaciju završiti u atreziji.
No, već od preantralnog stadija, folikuli steknu sposobnost da na daljnji rast i razvoj budu potaknuti gonadtropinima. Suprafiziološkim dozama egzogenih gonadotropina moći ćemo dio regrutacijske kohorte “spasiti” od atrezije pa će se veći broj folikula razviti do tercijarnog stadija. Zbirnu reakciju jajnika na egzogenu stimulaciju gonadotropinima nazivamo ovarijski odgovor, a mjerimo ga serumskim vrijednostima E2 na kraju stimulacije ovulacije i brojem jajnih stanica prikupljenih punkcijom folikula nakon stimulacije ovulacije.

3. Ovarijski odgovor - dob
Odmicanjem dobi smanjuje se ukupni broj folikula
O čemu ovisi ovarijski odgovor?
Svi znate da se svakim ciklusom regrutacije smanjuje ukupni broj “raspoloživih” folikula tako da se, s odmicanjem dobi, ukupna populacija folikula stalno smanjuje (pokazati na grafu padajući trend krivulje).
Osim toga, postoje značajne individualne razlike u broju folikula koji sudjeluju u pojedinom ciklusu regrutacije tako da, i u žena koje su identične po dobi, mogu postojati značajne individualne razlike u populaciji folikula (pokazati razliku krivulja 95%CI kod 35 godina - populacija može varirati od folikula)
Wallace and Kelsey. Human Ovarian Reserve from Conception to the Menopause. PLoS ONE 2011; 5: e8772

4. Ovarijski odgovor –doza gonadotropina
općenito, viša dob – slabiji odgovor, ali
širok individualni raspon u broju folikula u određenim dobnim kategorijama
(npr. u predikciji lošeg odgovora na stimulaciju ovulacije dob nije dobar pojedinačni prediktor -AUC ROC krivulje = 0,61; omjer vjerojatnosti ishoda 1.08; Bancszi i sur, 2002, HR)
kontinuirana potraga za preciznijim testovima ovarijske rezerve koji bi individualizirano predvidjeli ovarijski odgovor prije početka stimulacije ovulacije
Dakle, općenito, viša dob- slabiji odgovor, ali vidjeli ste, široki raspon broja folikula koji mogu odogovoriti na stimulaciju ovulacije razlog je zbog kojeg dob nije idealan prediktor ovarijskog odgovora. Kako optimalan odgovor na stimulaciju ovulacije ovisi i o dozi gonadotropina bez dobre predikcije ovarijskog odgovora nema ni optimalne stimulacije ovulacije. Suboptimalna doza rezultirat će suboptimalnim odgovorom, supraoptimalna prijeti razvojem OHSS-a.
To je razlog zašto se stalno traga za preciznijim testovima koji bi predvidjeli ovarijski odgovor prije početka stimulacije ovulacije.
DOZA
Suboptimalna
Optimalna
Supraoptimalna
ODGOVOR
Slab - POR
Optimalan
Pretjeran - OHSS

5. Danas se najpreciznijim smatraju i najšire su prihvaćeni AFC i AMH.
Testovi ovarijske rezerve/ovarijskog odgovora LH E2
FSH
inhibin B
AFC
AMH
Danas se najpreciznijim smatraju i najšire su prihvaćeni AFC i AMH.

6. AFC- antral follicle count
inicijalna regrutacija i razvoj do antralnog stadija
ciklička regrutacija od antralnog stadija do dominantnog folikula
Vratimo se na trenutak na sami početak i pogledajmo koji će dio folikulske populacije biti moguće procijeniti AFC-om.
Broekmans et al. Endocrine Reviews 2009, 30(5):465–493 6

7. AFC - antral follicle count
antralni folikuli su dostupni UZV vizualizaciji
u folikularnoj fazi ciklusa - anehogena uključenja promjera 2-9 mm
promjer se računa kao srednja vrijednost u dvije, međusobno okomite, osi
AFC = AFC-L + AFC-D
Zašto baš taj dio... 7

8. AMH-antiMüllerov hormon
inicijalna regrutacija i razvoj do antralnog stadija
ciklička regrutacija od antralnog stadija do dominantnog folikula
Sad pogledajmo koji će dio folikulske populacije biti moguće procijeniti AMH-om.
To su antralni folikula, ali samo onih promjera 2-5 mm, te populaciju preantalnih folikula…
Broekmans et al. Endocrine Reviews 2009, 30(5):465–493 8

9. AMH- antiMüllerov hormon
većina cirkulirajućeg AMH je sintetizirana u GS preantralnih i malih antralnih folikula
dimerni glikoprotein iz β-obitelji transformirajućih čimbenika rasta
od kasnog antenatalnog razdoblja do menopauze
Zašto baš ti...

10. Povezanost AFC-a i dobi
Ako pogledamo kako su AFC i AMH povezani s dobi, uočićemo da su i jedan (pokazati padajući trend)...
Almong B et al. Age-related normogram for antral follicle count: McGill reference guide. Fertil Steril 2011;95:663–6.

11. Povezanost AMH i dobi
i drugi (pokazati padajući trend) dobro povezani s dobi. 11

12. AMH & AFC
Povezanost između AFC i AMH je snažnija od povezanosti AFC-a i bilo kojeg drugog hormonskog markera koji se koristi u predikciji ovarijskog odgovora (inhibin B, estradiol, FSH and LH)
Fanchin R et al., HR 2003
A također su i snažno međusobno povezani.Štoviše povezanost između…
Correlation of AMH and AFC r p
Van Rooij et al. (2002)
0,77
<0,01
Fanchin et al. (2003)
0,74
<0,001

13. AMH & AFC inicijalna regrutacija i razvoj do antralnog stadija
ciklička regrutacija od antralnog stadija do dominantnog folikula
Zašto su AMH i AFC dobro povezani… I jedan i drugi korespondiraju sa brojem malih (2-5 mm) antralnih folikula…
Broekmans et al. Endocrine Reviews 2009, 30(5):465–493 13

14. AMH & AFC u predikciji pretjeranog ovarijskog odgovora
I jedan i drugi su dobri prediktori pretjeranog odgovora na stimulaciju ovulacije. Kao što se vidi u zaključku ove meta-analize – među njima nema značajne razlike.
Accuracy of the prediction of excessive response showed no statistically significant difference
Broer et al. AMH and AFC as predictors of excessive response in controlled ovarian hyperstimulation: a meta-analysis; Human Reproduction Update, Vol.17, No.1 pp. 46–54, 2011

15. AMH & AFC u predikciji slabog ovarijskog odgovora
Također, isto vrijedi i za predikciju slabog odgovora na stimualciju ovulacije.
The predictive value of AMH for poor ovarian response is comparable with AFC
van Rooij et al., Serum anti-Mullerian hormone levels: a novel measure of ovarian reserve; Human Reproduction Vol.17, No.12 pp. 3065–3071, 2002

16. AMH i AFC-a u predikciji odgovora na KOH
AMH & AFC
AMH i AFC-a u predikciji odgovora na KOH
La Marca, HRU, 2009
Van Rooij et al. (2002) =
Muttukrishna et al. (2005)
Eldar-Geva (2005) X
Ficicioglu et al. (2006) *
Lekamage et al. (2007)
Kwee et al. (2007) x
McIlveen et al. (2007)
Elgindy et al. (2008)
Jayaprakasan et al. (2008)
Brojne su studije uspoređivale koji je od ta dva markera bolji prediktor odgovora na stimualciju ovulacije, ali je zaključak meta-analize da…

17. AMH & AFC
It may be concluded that AFC and AMH perform with similar power in the prediction of the number of retrieved oocytes La Marca et al. Anti-Müllerian hormone (AMH) as a predictive marker in assisted reproductive technology (ART); HRU, 2009
Su oba markera jednako vrijedna u predikciji broja prikupljenih jajnih stanica

18. U slučajevima u kojima AMH “odgovara” AFC sve je jasno!
Dakle…
I AMH i AFC su dobri prediktori ovarijskog odgovora
I jedan i drugi su snažno povezani s dobi
Snažno su i međusobno povezani
U slučajevima u kojima AMH “odgovara” AFC sve je jasno!
U kojim slučajevima AMH i AFC neće ukazivati na isti status ovarijske rezerve (ovarijskog odgovora) i da li to može nositi kakve kliničke implikacije?
Da ponovimo…

19. Materijali i metode 430 pacijentica
AFC je određivan korištenjem dvodimenzionalne transvaginalne sonde 5-7 MHz (Toshiba, Nemio, Japan)
AMH koncentracija je određivana korištenjem AMH Gen II ELISA testa (Beckman Coulter, Inc., Brea, USA)

20. Materijali i metode log(pAMH) = -0.2577 + 1.2534 log(AFC), R2=0.698
na temelju AFC-a, ispitanice su razvrstane u tri grupe:
L-AFC (niski AFC) (AFC<7, N=59),
I-AFC (intermedijarni AFC) (AFC=7-20, N=173) and
H-AFC (visoki) (AFC>20, N=198).
na temelju našeg uzorka, ustanovili smo regresijsku jednadžbu:
log(pAMH) =   + 1.2534 log(AFC), R2=0.698
Temeljem AFC studijsku smo populaciju podijelili u tri skupine: L-AFC, I-AFC i H-AFC
The relationship between AFC and serum AMH concentration in all study subjects.
Sample size
430
Spearman's  coefficient of correlation (rho)
0.838
Significance level
P<0,0001
95% Confidence Interval rho
0.808 to 0.864

21. Materijali i metode
korištenjem regresijske jednadžbe, izračunate su očekivane serumske koncentracije AMH za svaku od graničnih vrijednosti AFC-a (AFC=7 i AFC=20). n
pAMH (pmol/L)
L-AFC (<7)
13.7% (59/430)
<6.31
I-AFC (7-20)
44.6% (192/430)
H-AFC (>20)
41.6% (179/430)
>23.6
rasponi očekivanih vrijednosti AMH u pacijentica u L-AFC, I-AFC i H-AFC kategoriji

22. Materijali i metode
dobivene očekivane vrijednosti (pAMH) su korištene za daljnju razdiobu ispitanica u skupine prema izmjerenim serumskim koncentracijama AMH (AMH): n
AMH (pmol/L)
L-AMH
9.7% (71/430)
<6.31
I-AMH
40.1% (176/430)
H-AMH
42.6% (183/430)
>23.6
Raspodjela ispitanica prema izmjerenim razinama AMH

23. Materijali i metode
Podudarnim AMH i AFC nalazom smatran je slučaj u kojem je izmjerena koncentracija AMH unutar raspona očekivanih vrijednosti AMH za određenu AFC kategoriju; odnosno,
izmjereni AMH je u očekivanom rasponu
Nepodudarnim AMH i AFC nalazom smatran je slučaj u kojem je izmjerena koncentracija AMH nije unutar raspona očekivanih vrijednosti AMH za određenu AFC kategoriju; odnosno,
izmjereni AMH je manji ili veći od očekivanog

24. PODUDARNI NALAZI AMH I AFC
Rezultati
PODUDARNI NALAZI AMH I AFC
AFC kategorija
AMH kategorija n
Očekivani odgovor
L-AFC(AFC<7)
L-AMH (AMH<6.31)
72.9%
(43/59)
slab
I-AFC (AFC 7-20)
I-AMH (AMH )
69.8%
(134/192)
umjeren
H-AFC (AFC>20)
H-AMH (AMH>23.6)
85.5%
(153/179)
Pretjeran
Ukupno podudarnih
76,7%
(330/430)

25. NEPODUDARNI NALAZI AMH I AFC
Rezultati
NEPODUDARNI NALAZI AMH I AFC
AFC kategorija
AMH kategorija n
Očekivani odgovor
L-AFC (AFC <7)
I-AMH (AMH )
27.1%
(16/59)
Slab/umjeren?
I-AFC(AFC 7-20)
L-AMH (AMH<6.31)
14.6%
(28/192)
I-AFC (AFC 7-20)
H-AMH (AMH>23.6)
15.6%
(30/192)
Umjeren/
Pretjeran ?
H-AFC (AFC>20)
13.5%
(26/179)
Ukupno nepodudarnih
23,3%
(100/430)
Mi zapravo tražimo ove…

26. Rezultati Sivo je označen udio podudarnih nalaza
Crveno je označen udio ispitanica kod kojih je izmjereni AMH viši od očekivanog
Plavo je označen udio ispitanica kod kojih je izmjereni AMH niži od očekivanog

27. Rezultati
Udio ispitanica s izmjerenim AMH nalazom većim od očekivanog najviši je u AFC<7 skupini 27,1%
Udio ispitanica s AMH nalazom manjim od očekivanog ne razlikuje se značajno u skupini s umjerenim i visokim AFC-om

28. Zaključak
U skupini s pacijentica s malim brojem antralnih folikula može se očekivati značajan udio diskordantnih nalaza, a te pacijentice možda nemaju tako lošu prognozu kao pacijentice s malim brojem antralnih folikula i niskim AMH-om
OPREZ kod informiranja pacijentice o njenim izgledima za uspjeh IVF postupka

29. Zaključak
U skupini pacijentica sa intermedijarnim brojem antralnih folikula, izmjereni AMH niži od očekivanog možda govori u prilog lošije prognoze u odnosu na pacijentice iz te skupine
OPREZ kod informiranja pacijentice o njenim izgledima za uspjeh IVF postupka

30. Zaključak
AMH koncentracija viša od očekivane u skupini s intermedijarnim AFC-om možda krije povećani rizik od OHSS-a u odnosu na ostale ispitanice u toj skupini
OPREZ kod određivanja inicijalne doze egzogenih gonadotropina!

31. Zaključak
U skupini s visokim AFC-om, niža vrijednost AMH će možda pomoći u odluci o izboru inicijalne doze
OPREZ kod određivanja inicijalne doze egzogenih gonadotropina!

32. Zaključak
AMH
AFC =
POOR
AMH
AFC = ?
AMH
AFC = ?
AMH
AFC =
HYPER

33. Zaključak
Definitivan odgovor na donijet će buduća istraživanja...

34. Off the record
pacijentice s L-AFC i I-AMH reagirat će slično kao L-AFC, L-AMH pacijentice (P = 0,1448)
POR (<4 oocite)
prevalencija 64.3%
AUC 0.707; P ;
AMH<=7.4 pmol/L: PPV 100%; NPV 42.9%

35. Off the record
pacijentice s I-AFC i L-AMH reagirat će slabije od I-AFC, I-AMH pacijentica odnosno kao L-AFC,I-AMH pacijentice (P = 0,2928)
POR (<4 oocite)
prevalencija 61,3%
AUC 0.665; P ;
AMH<=1.3 pmol/L: PPV 83.3%; NPV 43.1%

36. Off the record
pacijentice s I-AFC i H-AMH reagirat će jače od I-AFC, I-AMH (P=0,0006) pacijentica čak i uz značajno nižu ukupnu dozu gonadotropina dozu (21 vs 27, P<0,0001)

37. Off the record
pacijentice s H-AFC i I-AMH reagirat će slično kao H-AFC, H-AMH pacijentice (P = 0,3322)

38. Off the record
HYPER
HYPER
POR
POR

39. Clinical implications of the discordances between anti-Müllerian hormone (AMH) and antral follicle count (AFC)
Miro Šimun Alebić1 and Nataša Stojanović2 1Department of Human Reproduction, 2Institute of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Merkur Clinical Hospital, Zajčeva 19, Zagreb, CROATIA
Abstract ID: 1976
BACKGROUND. AMH and AFC strongly correlate with each other. Nevertheless, discordances between these ovarian reserve tests are sometimes encountered during infertility evaluation.
OBJECTIVE. To investigate cases with possible clinical implications of AMH-AFC discordances.
MATERIALS AND METHODS. A total of 430 patients of reproductive medicine department were enrolled in this study. AFC was assessed by a single investigator (MŠA) using a two-dimensional transvaginal probe 5-7 MHz (Toshiba, Nemio, Japan). AMH concentration was determined using AMH Gen II ELISA (Beckman Coulter, Inc., Brea, USA).
Based on AFC, the subjects were divided into three groups: L-AFC (AFC<7, N=59), I-AFC (AFC=7-20, N=173) and H-AFC (AFC>20, N=198). The predicted AMH values (pAMH) were calculated according to regression equation log(pAMH) =   + 1.2534 log(AFC), R2= The pAMH for AFC=7 and AFC=20 were used as cut-offs for subject division according to obtained AMH values: L-AMH (AMH<6.31 pmol/L, N=71), I-AMH (AMH= pmol/L; N=176) and H-AMH (AMH>23.59 pmol/L; N=183). Cases were considered „as predicted“ if found in AMH and AFC groups with an equal prefix. Overcounted and undercounted cases were those with AMH lower and higher than predicted according to AFC, respectively.
RESULTS.
log(pAMH) =   + 1.2534 log(AFC)
Figure 1. The relationship between AFC and serum AMH concentration in all study subjects.
Sample size
430
Spearman's coefficient of rank correlation (rho)
0.838
Significance level
P<0,0001
95% Confidence Interval for rho
0.808 to 0.864
CONCLUSION
Patients with discordances between AMH and AFC represent an additional clinical challenge. Undercounted cases in low AFC group and overcounted cases in intermediate AFC group may not have the same prognosis compared to their „as predicted“ counterparts.
Additionaly, AFC undercounting in intermediate group could mask the risk of ovarian hyperstimulation syndrome in these patients. Further research aiming at the associations of ovarian response and AMH and AFC in discordant cases could help in decision-making and better counselling of these patients.
Figure 2. Discordances in ovarian reserve estimation by AMH and AFC. The percentage of "as predicted" cases was similar among the AFC. Intermediate and high AFC groups had similar proportions of overcounted cases (16,2 vs 18,7%, P=0.621). A significant difference in the proportion of undercounted cases was observed between the low and the intermediate AFC group (27.1 vs 12.7%, P=0.017).