1. Analytické metódy

2. Serológia – súčasť imunológie, zaoberajúca sa reakciami medzi antigénom a protilátkou, základná diagnostická metóda v imunológii Serologické metódy – zisťujú prítomnosť protilátok zo séra pacienta proti infekčnému agens Sérum – tekutá nebunečná zložka krvi, ktorá neobsahuje zrážacie faktory krvi Plazma – na rozdiel od séra tieto faktory obsahuje. Sérová skúmavka s gelom Skúmavka s EDTA

3. Vyšetrenie parametrov humorálnej imunity Jednoduchá radiálna imunodifuze Najstaršia imunochemická metóda - stanovenie imunoglobulínov, komplementu Tvorba komplexu Ag - Ab v prostredí agarózy (0,5 – 2%) Aplikace antigénu do jamiek v gelu, ktorý obsahuje Ab. Podľa koncentrácie Ag vznikajú precipitačné prstence Priemer prstenca precipitátu je úmorný množstvu vyšetrovaného Ag Dvojitá imunodifuze Do jamiek sa aplikuje ako Ag tak aj Ab, ktoré difundujú proti sebe.

4. Stanovenie funkcie a zložiek komplementu Vyšetrenie C3 a C4 zložky C3 - najvyšia sérová koncentrace z komplementových proteínov. Klúčová komponenta komplementovej kaskády Chová sa ako proteín akútnej fáze, časté zvýšené koncentrace C4 - sa chová podobne ako C3 PATOLOGIE -PATOLOGIE + imunokomplexové choroby (zvl. SLE) bakteriální endokarditis kryoglobulinémie hypergamaglobulinémie vrozená deficience hereditární angioedém (HAE) akutní a chronické záněty

5. Vyšetrenie CH50 Testuje sa aktivácia komplementu klasickou cestou, ktorý je schopný lyzovať baranie erytrocyty senzibilzované králičou protilátkou Meria sa hemolýza erytrocytov po aktivácii komplementovej kaskády a vzniku MAC komplexu. PATOLOGIE -PATOLOGIE + hemokoagulace (DIC) vrozené deficience různých složek komplementu hereditární angioedém (HAE) dále viz snížení C3 a C4 nemá diagnostický význam Vyšetrenie C1 inhibítoru Dôležitý regulačný proteín, inhibujíci komplementovú kaskádu Význam stanovenia u chorých s heriditárnym angioneurotickým edénom (HAE)

6. Nefelometrie a turbidometrie Bežné analytické metódy používané k stanoveniu veľkej skupiny proteínov Merajú množstvo imunitných komplexov (špecifická vazba Ab s Ag) Koncentrácia antigénu je úmerná rýchlosti tvorby zákalu a hustote zákalu Nefelometria Meria intenzitu rozptýleného svetla od komplexu Ag s Ab Svetlo je merané detekčným systémom Turbidometria Optická metóda založená na meraní prechádzajúceho svetla Meria sa stupeň zákalu - turbidita

7. Elektroforéza bielkovín Separácie proteínov na základe ich pohyblivosti v elektrickom poli Sérové proteíny sa rozdelia na 5 hlavných frakcií Vyšetrenie pre zachytenie monoklonálneho imunoglobulínu – paraproteínu V prípade pozitívneho nálezu sa robí jeho typizácia imunofixačným vyšetrením

8. - - + + LEGENDA: vzorek č. 3: susp. paraprotein vzorek č. 7, 8: susp. paraprotein ostatní vzorky: polyklonální imunoglobuliny (norm. nález)

9. Imunofixácia Kombinácia elektroforézy s následnou imunoprecipitácoiu za použitia špecifických antisér Citlivá metóda Sérum sa rozdelí v gelu v niekoľkých dráhach Do každej dráhy je nanesené iné antisérum (IgG, IgA, IgM, kappa, lambda) Imunoglobulíny tvoria s antisérom komplex (precipitát). Bence Jensonova bielkovina - stanovuje sa v moči - proteinúria voľných ľahkých reťazcov

10. - - + + IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA ZDRAVÉ OSOBY LEGENDA: sloupec č. 1: elektroforéza séra další sloupce: imunochemický průkaz jednotlivých těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinů, je zřetelná polyklonální produkce

11. - - + + IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA NEMOCNÉHO S PARAPROTEINEM IgM LEGENDA: sloupec č. 1: monoklonální pruh na pozici 6 sloupec č. 4 a 6: imunochemický důkaz přítomnosti paraproteinu IgM

12. Vyšetrenia protilátok proti: 1, baktériám - Borrelia burgdorferi, Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum 2, vírusom - herpetické viry (HSV, EBV, CMV), HIV, hepatitída, klieštová encefalitída, 3, parazitom – Toxoplasma gondii, Toxocara canis

13. Aglutinace -Špecifická protilátka naviazaná na nosič (latex, erytrocyt) -V prítomnosti antigénu vo vzorku = aglutinace (viditelná zrazenina) -Reakcia funguje aj pri dôkaze protilátky, v tomto prípade je naviazaný na nosič antigén -Nevýhodou je nízka citlivosť

14. -Veľmi častá serologická metóda v imunológii -Detekcia protilátok aj antigénu Princíp -vazba antigénu na dno mikrotitračnej doštičky -pridanie pacientskej vzorky (vazba protilátky pri pozitivite) -pridaná druhá protilátka s naviazaním enzýmom -pridanie substrátu, ktorý je štiepený enzýmom naviazaným na druhej protilátke -farebná reakcia a fotometrické meranie ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Nepriama Elisa

15. Sendvičová Elisa – na dno doštičky je naviazaná protilátka, detekujeme antigén prítomný vo vzorku Mikrotitračná 96 – jamková doštička s 8-kanálovou pipetou a s príslušným roztokom konjugátu

16. Imunoblotting Kombinácia elektroforézy a vizualizačných metód Princíp - Rozdelenie antigénu infekčného agens na gely (agarózový, polyakrilamidový) podľa molekulovej hmotnosti - Prenesenie jednotlivých antigénov na nitrocelulózovú membránu (fixovanie) - Imunodetekcia (rovnaký postup ako pri Elise) - Vyhodnotenie vzorku - Často sa používa ako verifikačná metóda po Elise - vysoká špecifickosť a citlivosť

17. Výsledok imunoblotu s pacientskými vzorkami

18. Schéma vírusu Hepatitídy B

19. Dynamika tvorby protilátok u hepatitídy B

20. Chlamydia trachomatis IPReferenčná hodnota IP IgA1,09< 1,1 IgM0,41< 1,1 IgG0,81< 1,1 Chlamydia trachomatis IPReferenčná hodnota IP IgA1.64< 1,1 IgM0.31< 1,1 IgG0.92< 1,1 Chlamydia trachomatis ELISA: Prítomné pozitívne protilátky triedy IgA proti Chlamydia trachomatis, nárůst hladiny protilátok z hraničnej hodnoty (1.9.2010) na pozitívnu. Hladiny IgG protilátok majú hraničnú hodnotu – může sa jednať o počiatok infekcie. Protilátky IgM nemusia byť tvorené. Při stanovení diagnózy je veľmi dộležitý klinický obraz choroby! Diagnostika Chlamydia trachomatis - ELISA 1.odber 2. odber