1. ANALISIS DEL POLIMORFISMO GENETICO

2. Proyecto Genoma Humano
El proyecto Genoma Humano (HGP) se inició en 1990 y fue completado en 2003, fue coordinado por
U.S. Department of Energy
National Institutes of Health
Wellcome Trust (U.K.) en los primeros años
Otras contribuciones desde Japon, Francia, Alemania, China, y otros.

3. Beneficios del Proyecto Genoma Humano en Medicina
Mejor diagnóstico (dx temprano, específico) de enfermedades genética e infecciosas
Detección temprana de mayor susceptibilidad a enfermedades
Mejor diseño de drogas
Terapia génica y desarrollo de sistemas de control de drogas
Farmacogenómica

5. Análisis del Polimorfismo
RFLP - restriction fragment length polymorphism (Polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción).
AFLP - amplified fragment length polymorphism
RAPD - random amplification of polymorphic DNA
VNTR - variable number tandem repeat
SSR - simple sequence repeat

6. RFLP
RFLP - restriction fragment length polymorphism (Polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción).
Tecnologia mas antigua
Diferencia entre secuencias de DNA en la que un DNA presente una secuencia de restricción que el otro DNA no presenta.
Los sitios de restricción son polimorficos

7. RFLP Procedimiento: Corte con enzimas de restriccion
Separacion por electroforesis
Transferencia de DNA a filtro (Southern)
Hibridación sobre filtro: La sonda utilizada debe reconocer la secuencia donde se encuentra el sitio de restricción

8. LA ANEMIA FALCIFORME ES CAUSADA POR UNA MUTACION PUNTUAL
DNA CCT-GAG-GAG GEN NORMAL (Hb A)
Proteína Pro - Glu - Glu
DNA CCT GTG GAG GEN MUTANTE
Proteína Pro - Val - Glu Anemia Falciforme (Hb S)
Enzima de Restricción utilizada : Mst I

9. RFLP Analysis

11. RFLP Analysis

12. PCR – RFLP
PCR – se obtiene la secuencia target (OJO: aún cuando se obtenga un producto de tamaño definido, no necesariamente la secuencia de los productos es la misma)
Digestión con enzimas de restricción
Electroforesis en gel
Transferencia e hibridación con sondas específicas si es necesario

13. RAPD Random amplification of Polymorphic DNA
(amplificación al random de DNA polimórfico)
Primers de 10 bases
1 primer por reacción

14. RAPD Los primers se unen a varios sitios en el DNA templado
Template DNA
Los primers se unen a varios sitios en el DNA templado
Sólo cuando los primers se hayan unido en sitios cercanos y estén orientados en direcciones opuestas, ocurrirá la amplificación

15. RAPD
Template DNA
Primers apuntan hacia afuera, entonces no ocurrirá la amplificación

16. RAPD
Template DNA
Primers apuntan a la misma dirección, entonces la amplificación no ocurrirá.

17. RAPD
Template DNA
> 2,000 bases
Primers están muy alejados, entonces la amplificación no ocurrirá.

18. RAPD 100 - 1,500 bases Template DNA
Los Primers están a una distancia apropiada, ocurrirá la amplificación
,500 bases

19. VNTR
VNTR ( Variable Number of Tandem Repeats): Repeticiones en tandem de número variable.
Secuencias cortas ( bp) repetidas dentro de los sitios de restricción (si el análisis se hace por RFLP), o los sitios donde se anclan los primers (si el análisis es por PCR).

21. Repeticiones en tandem (Tandem Repeats)
VNTR Analysis
Sitio de restricción
Repeticiones en tandem (Tandem Repeats)

22. 4 repeticiones
9 repeticiones
17 pb

24. VNTR Analysis

25. SNPs
SNPs : Single nucleotide polymorphism (polimorfismo dado por la diferencia en un solo nucleótido)
Detección por PCR : primers diseñados con la misma secuencia pero con la ultima base (extremo 3’) cambiada según el polimorfismo que se quiera detectar.
DNA Templado 3´ ´
5´ ´ primer
La DNA polimerasa no puede iniciar aquí la extensión de la nueva cadena

26. SECUENCIAMIENTO DE DNA : Metodo de Sanger (uso de dideoxynucleótidos: ddNTPs)

27. Se realizan 4 reacciones por separado, los productos de cada tubo se visualizan en gel.
Figure 7-29a

28. Uso de dideoxynucleótidos en el secuenciamiento marcados con agentes fluorescentes

29. APLICACIONES Análisis evolutivo de especies relacionadas
Determinación de relaciones de filiación
Determinación de marcadores asociados con virulencia o alguna caracteristica fenotípica (pero no significa causalidad)
Determinación de polimorfismos que causan una enfermedad (dependiendo de dónde ocurre el cambio)

31. Región en el DNA no transcrita Inicio de Transcripción+1
downstream
upstream
GEN
pppAAGUCACGUAAAGGGUAUCGACAAUGAAAGCAAU...
Met-Lys-Ala- -
Región transcrita pero no traducida
5´ UTR (untranslated region)
Inicio de Traducción

32. Región promotora ´UTR

33. Secuencias repetitivas simples
1. DNA satélite: pb en tándem (extensiones en el
orden de las megabases, ~ 106 pb)
Centrómero
DNA minisatélite: pb en tándem (~ pb)
Conservado: telómeros
Hipervariable (longitud): cerca de telómeros
→ identificación de individuos (“fingerprint”)
3. DNA microsatélite: 1-5 pb en tándem (10-40 pb)
Distribuidos de manera uniforme
Longitud variable → relaciones filogenéticas

34. Uso de minisatélites hipervariables en la identificación de individuos
1. Digestión de DNA con
enzimas de restricción
2. Separación de fragmentos
por electroforesis
3. Transferencia de DNA a
membrana
4. Hibridación con sonda con
secuencia de minisatélite
marcada radioactivamente

35. Análisis de polimorfismo de tamaño de cromosomas en Leishmania
Comparación por PFGE del tamaño de cromosomas en cepas y aislamientos de pacientes de diferentes regiones del Perú
Variación de tamaño por amplificación /eliminación de genes ribosomales repetidos en tándem:

36. Polimorfismo en cromosoma que contiene los genes ribosomales en Leishmanias del complejo Viannia.

39. EJERCICIO
Usted desea determinar por PCR si un paciente es portador del gen de la anemia falciforme.
Indique:
a) dónde ubicaría los primers a usar b) cuál sería el procedimiento a seguir c) cómo espera usted que sean los resultados