1. 临床用 PCR 检测常见的问题及 科华 PCR 试剂特点 曹玉峰 上海科华生物工程股份有限公司

2. 目前 PCR 的应用 核酸是最基本的生命物质，其贮存着生物体的全 部遗传信息，直接或间接的参与所有生命过程。 理论上任何疾病都能在核酸水平找到证据。 随着对核酸功能认识的逐渐深入，核酸检测在医疗诊 治过程中起着越来越重要的作用。 核酸检测在临床上主要应用于： 能用于遗传性疾病、肿瘤以及感染性疾病的筛查以及 疗效监测等方面 由于对基因功能认识的限制，国内主要进行病原体载 量检测，用于疗效监测

3. 核酸检测的特点 核酸检测相对于传统的生化、免疫检测有着不同 的检测方法及生理意义。 早期筛查：应用 PCR 进行早期筛查主要是因为 PCR 的 高灵敏和短的窗口期。 疗效监测：反映抗病毒治疗效果的最好指标。 核酸是病毒存在的直接证据，用核酸定量作为监测指 标更灵敏。而传统的血清标志物有滞后效应，效果不 如核酸理想。 与酶免检测互补： 方法学互补，可以避免亚型或免疫沉寂引起的漏检 临床作用互补

4. 临床 PCR 检测的常见问题 假阳性问题 方法学问题 污染问题： 样本污染、产物污染 假阴性问题 试剂因素、操作因素、仪器因素、标本因素 定量问题 外标定量与内标定量

5. 假阳性问题及解决办法 方法学： PCR 是特异性非常高的检测方法 PCR 引物决定了特异性 靶基因序列的特异性、引物错配、非特异性扩增 实时荧光（ Real-time ）：引物探针同时控制，几乎没有方法学假 阳性问题 污染： 样本污染：应属于操作失误，所有技术都存在，但由于 PCR 高敏 度轻微污染也能被检出。 产物污染：最严重的问题 PCR 产物是极高浓度的，所以很可能产生污染 解决办法： 使用实时荧光技术 严格分区及实验人员培训 使用 UNG 技术

6. UNG/dUTP 消除产物污染 原理： UNG 酶是一种限制性水解酶，会将 dUTP 降解。 在 PCR 体系中以 dUTP 代替 dTTP ，这样合成的 产物就含有 U ，而模板只含 T 不含 U ，如果出现 产物污染， UNG 酶会降解掉产物，而对模板无 影响。 步骤： UNG 酶反应， 50 ℃ UNG 酶灭活， 94 ℃ 开始扩增循环

7. UNG/dUTP 消除产物污染

11. 假阴性问题及解决办法 试剂因素 阳性对照可以监测和发现 操作因素 提高操作人员素质 降低操作难度（柱提取、磁珠提取等） 阳性对照监控 仪器因素 离心、温度控制精确度 仪器故障、由阳性对照（或标准曲线）监控 孔间因素，使用内对照监控 标本因素 使用抗干扰能力强的试剂（煮沸二步法、柱提取等） 使用内对照

12. 定量相关的问题 外标定量的前提： 假设所有扩增的扩增效率一致 所以能影响扩增效率的因素都能影响定量结果 核酸定量没有决定性方法 只有同类著名试剂（罗氏）作为参照标准 PCR 定量重复性不好， 10 倍以为大体都正确， 不能同生化类比 PCR 标准品没有准确的定量值 国家标准也是 8 倍左右的范围值

13. 外标定量与内标定量 内标定量 将标准品加入样本中一齐处理、检测 优点： 标准品和样本的反应完全一致，误差最小定量最准确 缺点： 只能一点定标，线性范围有限，ＰＣＲ定量是指数级范围，不 适用 标准与样本的信号区分要不同的检测信号，难度大，成本高 外标定量 标准同批，分管处理检测 优点： 能做标准曲线定量，线性范围宽 成本低，易实现 缺点： 反应情况的同步性不如内标定量

14. 科华 PCR 试剂盒特点 及新进展

15. 试剂盒三大特点： 提供负压纯化柱提取及磁珠提取方法 使用双色荧光设计内标，避免假阴性 标准品参与提取

16. PCR 检测核酸提取是关键 自动化程度已 经很高，操作 难度已经降低 成为操作难点， 是保证实验结果 的关键。 核酸提取 循环扩增 结果检测与分析

17. PCR 的新进展 酶的稳定性增强 经过免疫或化学修饰后酶的稳定性有大幅度增 强 但配置后长期存放仍然不利 提取方法的进步 煮沸、柱提取、磁珠提取 自动化 半自动、全自动

18. 常见的核酸提取方法 煮沸法 柱提取磁珠法 一步法二步法 裂解方法煮沸 化学裂解 分离方法离心 亲和吸附吸附或杂交 步骤 1. 煮沸裂解 2. 离心，去除大 分子的抑制物 3. 取上清扩增 1. 加入沉淀剂 2. 离心弃上清， 浓缩标本并去 除小分子抑制 物 3. 煮沸裂解 4. 离心，取上清 扩增，去除大 分子抑制物。 1. 化学裂解 2. 过柱吸附 3. 洗涤 4. 洗脱 5. 取洗脱液扩增 1. 化学裂解 2. 加磁珠吸附 3. 洗涤 4. 洗脱 5. 取洗脱液扩增 抗干扰能力差较好好最好 提取物组分较小分子量的混合 物 与核酸相似分子量 的混合物 全核酸特定病原的核酸 自动化程度手工 手工或自动半自动或全自动

19. 煮沸法提取核酸 第一步：加沉淀剂，离心弃上清 去除小分子聚合酶抑制物 浓缩病毒颗粒，提高灵敏度 第二步：加裂解液，煮沸 裂解病毒颗粒，游离核酸 变性残留蛋白质 第三步：取上清扩增 去除大分子聚合酶抑制物

20. 负压纯化柱抽提原理 原理：采用硅胶膜特异 性吸附核酸，而对其 他生化组分如蛋白质、 多糖、脂类既不相亲 也不吸附，因而可得 到纯化的核酸

21. 负压纯化柱抽提操作 裂解 ↓ 移入柱 ↓ 洗涤两次 ↓ 洗脱

22. 负压纯化柱抽提的优点 操作难度低，易于掌握 纯度高 适应性强：能用于各种 DNA 、 RNA 病毒 提取物可用于其他分子生物学检测 对离心要求低 对实验环境无污染

23. 磁珠法提取原理 原理： 标本中的病毒经裂解、消化后，释放出病毒核酸，核 酸与磁珠结合 ( 特异性的和非特异性的 ) 利用磁珠分离仪 器将病毒核酸提取纯化，作为 PCR 反应的模板。 分类： 亲和法：提取全核酸，特异性差 杂交法：利用特异性探针捕获，提取目标核酸 步骤： 裂解、吸附、洗涤、洗脱

24. 科华磁珠提取试剂 自动化模式：采用国内国外的相关的全自动或半自动核酸提取仪，实 现了自动化抽提核酸 高通量，时间短：一次可处理 96 份标本，仅需 80 分钟 同步提取： RNA 病毒、 DNA 病毒核酸同步提取；基于探针杂交原理, 特异性捕获病毒的核酸； 为目前 FDA 批准的血液核酸筛查试剂 ----Roche 的 “AmpliScreen®” 及 Gen-probe 的 “TMA” 均所采用的标本处理方法，代表当前最先进、最 灵敏的标本提取方法 灵敏度高： HBV,HIV 均为 25copies/ml, HCV 为 50IU/ml 特异性强：基于杂交原理, 特异性捕获病毒的核酸，抗干扰性能强 重复性好：连续八次（不同日内）检测不同浓度的标本，结果 CV 不 大于 5% 通用性强，适于各种磁珠提取核酸仪器。

25. 灵敏度 灵敏度： HBV,HIV 均为 25copies/ml, HCV 为 50IU/ml 梯度稀释的样本 10 2 能 100% 检出 10 1 能检出 60% 以上 通过离心浓缩可以确保 10 － 20 份样本 POOL 保持同等的检出率

26. 重复性（批内） 孔间 CV ：试剂检测灵敏度以上、线性范围内的标本的孔间 CV 不大于 5%

27. 重复性（批间） 连续八次（不同日内）检测不同浓度的标本，结果 CV 不大于 5%

28. 抗污染性实验 按矩阵以 1×108copies/ml 的血清包围中间一份阴性血清，以及阴性血清包 围 1 份 1×108copies/ml 的血清；重复三次，未见污染发生。

29. 操作步骤 试剂准备 取 6 块反应板，分别用排枪或滴瓶加入去抑制 剂、磁珠、洗涤液 A 、洗涤液 B 、洗涤液 C 以及 洗脱液 量产后，可以将试剂封入板中不在需要准备 在第一块板中加入待检血样 跟据提取仪的不同，上机提取 用排枪将洗脱液加入相应的扩增反应板中 进行扩增检测

30. 配套磁珠仪器 试剂通用性强 绝大部分磁珠核酸提取仪器均能使用（有加热模块即 可） 自产配套磁珠提取仪器 具有高效的加热模块、稳定的温控系统 非板式混均系统 程序预设控制 预防污染设计 体积小能放入生物安全柜操作 很高的性价比

31. 内标设计原理 内标为一已知低含量的 与模板扩增效率相似的 一段 DNA 片段，将它加 入 PCR 反应液中，与模 板共同扩增，以反应每 管真实的扩增情况，如 果内标和样品都未扩增 出结果，则表示该管扩 增无效，应重新做。 样本 内标

32. 内标：避免假阴性 内标的种类： 同源、异源、竞争、非竞争 使用竞争性内标 真实反应扩增情况 建立每管质控体系 避免假阴性 科华试剂不使用内标定量 由于线性范围原因，仍用外标定量

33. 标准品参与提取 标准品与标本同样处理结果更准确 重复性更好 定量更准确 不需要额外的阳性对照 实质上四个阳性对照 降低了成本

34. Fluocycle PCR 实时荧光 PCR 仪

35. 产品特点 全中文临床中文软件：界面友好，易于操作。 采用空气加热系统，温度升降速度快： 升温速度大于 6 ℃ ∕S ，降温速度大于 5 ℃ ∕S 。 采用玻璃毛细管作反应管，表面积 / 容积比较高，确保管内温度与热室 的迅速平衡 标本用量少, 每个样本量仅需 20ul 。 寿命超高亮度的 LED 光源。 PMT 检测。 完善的数据输出方式：列表形式以及报告形式任意选择。 最多可检测 3 个波长的激发荧光（包括 525nm ， 640nm ， 710nm ）。 实时检测，绝对定量：可实时监控、显示样品的动态反映，检测结果 即样品原始浓度。

36. 乙肝新药证书及生产批文 国药证字 S20030034 国药准字 S20030059

37. 国药证字 S20040034 国药准字 2004S03676 丙肝新药证书及生产批文

38. 谢 谢 ！