1. Proteínas de fusión
2 problemas principales con la expresión de proteínas foráneas
Degradación
Purificación

2. Proteínas de fusión Degradación Una solución para la degradación
produce un nivel bajo de expresión
es dificil la purificación de la proteína deseada
Una solución para la degradación
Unir la proteína target a una proteína celular estable (tag o carrier)

3. Proteínas de fusión Proteína de fusión (a nivel DNA o genes)
Región que codifica una proteína celular fusionada en marco de lectura a la región que codifica para la proteína target
Cuando se transcribe y traduce genera una proteína de fusión

4. Proteínas de fusión Carrier o tag
en el extremo -NH2 o –COOH de la proteína
- un dominio con actividad catalítica
- un dominio antigénico
- una señal peptídica topogénica
protege de proteólisis a la proteína de interés
mejora la solubilidad de la proteína
estabiliza a la proteína de interés

5. Proteínas de fusión stable gene gene of interest
MET ... LEU ARG THR MET VAL ILE ... End
ATG ... GTG CGA ACC ATG GTG ATC ... TAG
Nco I
Note: translation stop of cellular gene must be removed
Note: reading frame of fusion protein must be contiguous

6. Proteínas de fusión Clivado por proteasas
Clivan una corta y definida secuencia de aa
La secuencia de clivado para la proteasa entre el gen carrier y el gen de interés
protease cleavage sequence
fusion partner
gene of interest

7. Sitio de clivado para el Factor Xa

8. Purificación de proteínas de fusión
La proteína de fusión se une a una molécula pequeña o anticuerpo (Ab)
La molécula pequeña o Ab pueden estar unidos a una matriz inerte
La proteína de fusión se unirá, las otras no
La proteína purificada se eluirá de la columna

9. Purificación por cromatografía de afinidad3 1 2 4

11. Proteínas de fusión
A veces la sobreexpresión puede reducir la cantidad de proteína recuperada
La proteína forma agregados insolubles: Cuerpos de inclusión
La formación de agregados puede deberse a un plegamiento incorrecto

12. Proteínas de fusión Soluciones a la formación de cuerpos de inclusión
proteína de fusión con tioredoxina (soluble)
Proteína de fusión con péptido señal, por ej. de la fosfatasa alcalina (periplasma)
Tratamiento con agentes caotrópicos (urea, cloruro de guanidinio)

13. pRSET Expression Vector
The pRSET vector is designed for high-level prokaryotic expression controlled by the strong bacteriophage T7 promoter. Expression is induced by the production of T7 RNA polymerase in the BL21(DE3)pLysS host E. coli cells. These cells also produce T7 lysozyme to reduce basal expression of target genes. The pRSETvector offers:
High-level expression from the bacteriophage T7 promoter
T7 gene 10 sequence to provide protein stability
N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid purification with ProBond® resin
N-terminal Xpress® epitope for protein detection with the Anti-Xpress® Antibody
Enterokinase cleavage site for removal of fusion tag
f1 origin for ssDNA rescue to allow easy sequencing and mutagenesis