1. 微生物研究法 D 組 報告者：曾仁志 報告日期： 2005/9/19 題目： (1)CO 2 、 Sodium bicarbonate 和 HEPES buffer 對培養基 pH 值的調控。 (2) 成立一個細胞學實驗室需要什麼需求。

2. 培養基 pH 值的變動對細胞造成的影響 哺乳動物細胞最適生長的 pH 範圍為 7.2~7.4 ，過酸或過鹼 都會對細胞生長不良或造成傷害，故讓培養基的 pH 值穩定 是相當重要。 For example ： Articular Chondrocytes( 關節軟骨細胞 ) ，主要的能量來 源是透過糖解作用之無氧代謝， Pyruvate 轉換成 lactic acid ，會迅速酸化培養基而導致抑制細胞生理及代謝。 Glucose Glycolysis Glucose-6-phosphate Pyruvate Lactic acid pH↓ Cell

3. CO 2 、 Sodium bicarbonate 和 HEPES buffer 對培養基 pH 值的調控 培養基的 pH buffer system 最常用 NaHCO 3 加入培養 基中，以 CO 2 來調整 pH 在適當之範圍 (HCO 3 - + H + H 2 CO 3 CO 2 + H 2 O) 。 ※細胞生長需要 CO 2 的環境，然而在 CO 2 incubator 不斷 的補充 CO 2 下，培養基會越來越酸。加 sodium bicarbonate 進去，使 HCO 3 - 去抓住 H + 來平衡 pH 值。 然而在細胞生長快速及 carbonic anhydrase 的存在下， 培養基會酸化的更快，故以添加 HEPES 來穩固細胞生 長最適之 pH 的環境。

4. CO 2 、 Sodium bicarbonate 和 HEPES buffer 對培養基 pH 值的調控

5. HEPES 當培養基之緩衝液之優缺點 以 HEPES 當培養基之緩衝液之優缺點 優點：對細胞毒性較小，適用於多種類型細胞的培養。 ( 參見 表一 ) 盡可能避免光照 缺點：長期暴露於光照下， 會產生具細胞毒性之自由基。 ( 但是只要避光保存便可避免， 此問題較易解決。 )

6. 參考資料 表一、各種常用緩衝液及其使用範圍 緩衝液適用 pH 值使用上注意 Formate3.0~4.5 會溶解細胞膜上的蛋白質。 Citrate3.0~6.2 小心會與二價金屬離子結合。 Acetate3.7~5.5 容易揮發，可用冷凍乾燥除去。 Phosphate5.8~8.0 小心會與鈣離子結合沉澱，低溫下易結晶。 HEPES6.5~8.5 毒性較小多用在細胞培養。 Tris7.1~8.9 pH 值受溫度影響很大。 Carbonate9.7~10.7 小心會與金屬離子結合沉澱。

7. Phosphate buffer with or without Ca 2+ Phosphate buffer without Ca 2+ ： 多應用於細胞培養之沖洗。 With or without Ca 2+ ? Why ?

8. Phosphate buffer with or without Ca 2+ Phosphate buffer 與鈣離子結合沉澱的原因： 溶液的 pH 值  在溶液中，磷酸鹽是以三價的磷酸根（ PO 4 3- ）、二價的磷酸氫根 （ HPO 4 2- ）和一價的磷酸二氫根（ H 2 PO 4 - ）存在，這三個離子會 維持一個平衡的狀態，但是 PO 4 3- 要在強鹼（ pH 值很大時）的情 況下才會存在，所以在 phosphate buffer 溶液中只可能以 HPO 4 2- 及 H 2 PO 4 - 存在。  HPO 4 2- 較會和鈣離子產生沉澱。在 pH 值 7.4 時會有 80% 的 HPO 4 2- 存在，較會和鈣離子產生沉澱；若 pH 值下降至 5.4 時，則有 96% 的 H 2 PO 4 - 的存在，這樣一來就減少產生磷酸鈣沉澱的機會。所以 溶液 pH 值影響鈣磷沉澱很大， pH 值較低時，發生沉澱的機會也 較低。

9. Phosphate buffer with or without Ca 2+

10. 成立一個細胞學實驗室的基本需求 設計細胞實驗室之基本考量 1. 細胞培養最害怕的就是污染的問題，因此提供一個無 菌的設備、環境及無菌操作技術是十分重要的 。 UV 殺菌燈

11. 設計細胞實驗室之基本考量 無菌操作臺滅菌器

12. 設計細胞實驗室之基本考量 2. 細胞培養室與其他工作室隔離，需有 2~3 道門，要有 緩衝區來更換鞋子與實驗衣。 Air shower

13. 設計細胞實驗室之基本考量 3. 細胞培養箱、冰箱、桌上型離心機、顯微鏡等設備 。 Incubator 冰箱

14. 細胞實驗室之基本配備 離心機顯微鏡

15. 細胞實驗室之基本配備 其他設備 1. 水浴槽 2. 液態氮 3.-20 ℃ 、 -80 ℃ 、 4 ℃ 等冰箱。 4. 其他的視實驗需求而定。

16. 參考文獻 Fisk A., Pathak S., (1969) HEPES-buffered medium for organ culture. Nature. 224, 1030-1031. Waldman S.D., Couto D.C., Omelon S.J., Kandel R.A., (2004) Effect of sodium bicarbonate on extracellular pH, matrix accumulation, and morphology of cultured articular chondrocytes. Tissue Engineering. 10, 1633-1640.