1. FISH技术在肿瘤病理诊断及肿瘤分子靶点治疗中的应用
王芳 邵建永
中山大学肿瘤防治中心
分子病理诊断实验室

2. Fluorescence in situ hybridization
（FISH）
细胞遗传学技术
原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA
靶序列杂交
观察：荧光显微镜
原位观察（细胞、组织）细胞核
彩色探针信号
目的：获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种
基因状态的信息。

3. 用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位 原理
荧光标记探针
探针变性
样本DNA变性 杂交

4. FISH技术的特点 操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合， 可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析
方法敏感，能迅速得到结果，24小时就可以完成检测
标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测

5. FISH探针的种类 CSP探针：染色体着丝粒探针 GLP探针：位点特异性探针 WPP探针：全染色体或染色体区域特异性探针
telomere subtelomere
whole chromosome paint
centromere
locus
specific

6. 操作流程简图 制片
预处理
FISH
结果分析
破坏细胞膜利于探针
杂交。
蛋白酶消化、HCl处理 变性 杂交 洗涤 复染

7. FISH技术在乳腺癌检测中的应用

8. 乳腺癌 Her-2基因 致癌基因：Her-2基因； 位点：17q11.2-q12； 编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同源）；
HER-2基因扩增是决定Herceptin治疗是否有效的关键性指标。

9. Her-2基因的检测方法 检测方法 检测指标 优点 缺点 IHC Her-2蛋白 费用低 光镜即可观察结果 准确性差，主观性强，假阳性率高
CISH
Her-2 DNA
对低度扩增及染色体非整倍扩增检测灵敏度下降
FISH
对于低倍、高倍染色体非整倍性扩增检测准确性高，灵敏度特异性好，结果判断客观
相对费用较高

10. Her-2基因FISH 探针组 疾病 名称 检测探针 标记颜色 探针定位 探针名称 乳腺癌 GLP Her2 / CSP17 红/绿
Her2： 17q11.2-q12
CSP17:
17p11.1q11.1
CSP17:17号染色体着丝粒
正常: 2红/2绿
异常: 红信号大于2为异常细胞(绿色信号不少于2个的细胞)

11. DAPI染色后与HE切片对比图
观察浸润部分
导管内癌

12. 结果判断 统计Ratio值（计数浸润性部分的20个细胞） Ratio值＝20个细胞核中红信号总数/绿信号总数 Ratio＜1.8 为阴性结果
比值2～4为低度扩增
4～10为中度扩增
>10为高度扩增
Ratio在 之间时，则需要再计数20个细胞核中
的信号。如仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明。

13. Her-2基因扩增状况 B A A. 无须计数的大簇团信号（高度扩增） B. 颗粒状信号（R>10，高度扩增）
C. 须计数的颗粒状信号（R=3.5，低度扩增） C

14. Her-2基因无扩增情况
红信号数>2，同时绿信号非整倍体R<1.8，无扩增
红信号与绿信号均为两点，R=1

15. 荧光原位杂交与免疫组化检测Her-2结果比较

16. 我实验室已完成病例小结 IHC 总数 0 1+ 2+ 3+ FISH 无扩增 13 3 4 0 20 扩增 2 2 10 29 43
FISH
(n=15) (n=5) (n=14) (n=29) （n=63）
无扩增 扩增
Her2表达IHC（2+）标本中，基因扩增率为71.41%
Her2表达IHC（3+）标本中，基因扩增率为100%
（文献报道：90-95%）

17. 免疫组化（3+）与FISH对比图 ×40 ×100 ×100 >30%的肿瘤细胞全部 的细胞膜高强度着色 住院号：177319
浸润性导管癌Ⅱ级
IHC：+++
FISH：呈簇团状高度扩增

18. 免疫组化（2+）与FISH对比图 1. ×40 ×100 住院号：175465 >30%的肿瘤细胞全部 浸润性导管癌Ⅱ级
的细胞膜弱至中等着色
×40
住院号：175465
浸润性导管癌Ⅱ级
IHC：++
FISH：Ratio>5，中度扩增
×100

19. 免疫组化（2+）与FISH对比图 2. >30%的肿瘤细胞全部 的细胞膜弱至中等着色 ×40 ×100 住院号：176921
浸润性导管癌Ⅱ级
IHC：++
FISH：Ratio＝1.45，无扩增

20. 免疫组化（1+）与FISH对比图1 ×40 ×100 >30%的肿瘤细胞弱的着色 住院号：175689 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC：+
FISH： Ratio＝1.62，无扩增

21. 免疫组化（1+）与FISH对比图2 ×100 ×40 住院号：175895 浸润性导管癌Ⅲ级 >30%的肿瘤细胞弱的着色 IHC：+

22. 免疫组化（－）与FISH对比图1 ×40 ×100 住院号：176846 浸润性导管癌Ⅱ级 <30%的肿瘤细胞弱的着色或不着色
IHC：－
FISH： Ratio＝1.02， Her2基因无扩增
<30%的肿瘤细胞弱的着色或不着色

23. 免疫组化（－）与FISH对比图2
×40
×100
住院号：175472
浸润性导管癌Ⅱ级
IHC：－
FISH：呈簇状扩增
肿瘤细胞不着色

24. 评价17号染色体的意义 评价Her-2基因状态的同时应考虑 17号染色体数目的变化
17号染色体非整倍性：每个细胞中17号染色体多于或少于2个；
乳腺癌遗传学特征之一，可能预示预后不良；
17号染色体多体性是导致IHC 3+但FISH检测为阴性的主要原因；
我实验室完成病例中17号染色体非整倍性发生率为33.3%。
评价Her-2基因状态的同时应考虑
17号染色体数目的变化

25. IHC与FISH结果不一致原因分析 IHC判断标准的主观性 排除IHC假阴性 由于17号染色体多体性造成假性扩增 IHC自身无法克服的缺陷
内对照探针——17号染色体着丝粒探针的建立，
排除IHC假阴性
IHC 2+及3+的基因检测结果分离，无法控制
由于17号染色体多体性造成假性扩增
IHC自身无法克服的缺陷
基因扩增是Herceptin
使用的关键性指标

26. Her2基因检测流程 石蜡组织标本 IHC检测 FISH检测 1+ 2+ 3+ + Herceptin治疗 Herceptin治疗 + —
方法检测
再用FISH
方法检测 — + +
再用FISH
方法检测
Herceptin治疗
Herceptin治疗 +

27. 乳腺癌HER2 FISH检测报告模板

28. FISH技术检测染色体易位在淋巴瘤分型中的应用

29. HE＋IHC + cytogenesis = 解决!难
淋巴瘤的诊断与分型
HE＋IHC + cytogenesis = 解决!

30. 不同类型的淋巴瘤有各自不同的染色体易位
使控制细胞发育分化过程中的关键蛋白失活
与淋巴瘤的发生密切相关

31. 目前开展的染色体易位检测（6种）： IGH/BCL2 t (14;18) (q32;q21) 染色体易位
IGH/MYC t (8;14) (q24;q32) 染色体易位
IGH/CCND1 t(11; 14)(q13; q32) 染色体易位
API2/MALT1 t(11;18)(q21;q21)染色体易位
IGH/MALT1 t (14;18) (q32;q21)染色体易位
BCR/ABL t(9;22)染色体易位【费城染色体】

32. 意义： 影响检出率的原因： 蛋白，IGH基因附近的增强子使BCL2 过表达 DLBCL 20% ～ 30%出现易位
t (14;18) (q32;q21) 染色体易位
意义：
t (14;18)易位后形成的IGH/BCL2基因能编码完整BCL2
蛋白，IGH基因附近的增强子使BCL2 过表达
t (14;18)为FL的标志（低级别更易出现）,检出率达93%～100%
DLBCL 20% ～ 30%出现易位
影响检出率的原因：
石蜡标本中DNA的降解
FL3b接近DLBCL，其易位率低，影响总体检出率

33. IGH/BCL2 Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe5 3
C region
V region
J region
14q32 region 3
MCR
MBR
18q21 region

34. 探针杂交示意图 检测探针 标记颜色 探针定位 IGH / BCL2 green/orange IGH: 14q32 BCL2: 18q21
易位探针杂交后显示2O2G信号
肿瘤细胞核IGH/BCL2 双色双融合
易位探针杂交后显示1O1G2F信号
检测探针
标记颜色
探针定位
IGH / BCL2
green/orange
IGH: 14q32
BCL2: 18q21 
正常: 2O/2G
异常: 1O/1G/1F
阳性标准: >7%的细胞出现黄色融合信号

35. 4×
40×
病例1：会诊84363，男，74y
腹腔肿物；
FISH：54%的细胞可见融合信号；
诊断：FLⅡ~Ⅲ。
100×

36. 病例2：会诊84362，女、36 颈部肿物 抗炎治疗后（出现变性坏死） 诊断：DLBCL FISH：阳性，10%的细胞可见融合信号
40×
IHC:BCL2
100×
病例2：会诊84362，女、36
颈部肿物
抗炎治疗后（出现变性坏死）
诊断：DLBCL
FISH：阳性，10%的细胞可见融合信号

37. t (8;14) (q24;q32) 染色体易位 意义： 应用范围： 白，IGH基因附近的增强子使MYC过表达
t (8;14)易位后形成的IGH/MYC基因能编码完整MYC蛋
白，IGH基因附近的增强子使MYC过表达
应用范围：
所有Burkitt淋巴瘤都有t (8;14)易位
诊断不典型Burkitt淋巴瘤须有t (8;14)易位的MYC异常
可见于继发于滤泡性淋巴瘤的前驱B淋巴母细胞白血病/
淋巴瘤

38. IGH/MYC, CEP8 Tri Color, Dual Fusion Translocation Probe
14q32 region
C region
V region
C region
8q24 region
MYC

39. 探针杂交示意图 检测探针 标记颜色 探针定位 LSI IGH green 14q32 LSI MYC orange 8q24 CEP 8
正常细胞核IGH/MYC, CEP8 三色双融合易位探针杂交后显示2R2G2A信号
肿瘤细胞核IGH/MYC 双色双融合
易位探针杂交后显示1O1G2F信号
检测探针
标记颜色
探针定位
LSI IGH 
green
14q32 
LSI MYC 
orange
8q24
CEP 8 
aqua
8p11.1-q11.1
正常:2G/2O/2A
异常:1G/1R/2F/1A或>2A

40. 病例3: 399318，女、5y 颈淋巴结活检； ISH: EBERs（+）； FISH:45%的细胞可见融合信号；
10×
40×
病例3: ，女、5y
颈淋巴结活检；
ISH: EBERs（+）；
FISH:45%的细胞可见融合信号；
诊断：散发性经典型BL。

41. 病例4: 405618，女，21y 盆腔肿物穿刺； ISH: EBERs（+）； FISH: 23%的细胞可见融合信号；4×
40×
病例4: ，女，21y
盆腔肿物穿刺；
ISH: EBERs（+）；
FISH: 23%的细胞可见融合信号；
诊断：考虑为散发性经典型BL。
活检穿刺标本

42. 病例5:399625，男、42y ISH:EBERs（-）； 经多学科大会诊； 诊断：较符合散发性非典型BL；
40× 4×
病例5:399625，男、42y
ISH:EBERs（-）；
经多学科大会诊；
诊断：较符合散发性非典型BL；
FISH: 25%的细胞可见融合信号；
活检穿刺标本

43. t (11; 14)(q13; q32) 染色体易位 意义 应用范围 强子使 Cyclin D1过表达 套细胞淋巴瘤的诊断性指标
t (11;14)易位后形成IGH/CCND1基因，IgH基因附近的增
强子使 Cyclin D1过表达
应用范围
套细胞淋巴瘤的诊断性指标
也出现过零星其它淋巴瘤t (11;14)易位的检出

44. IGH/CCND1Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe
14q32 region
C region
V region
J chain
11q13 region

45. 简洁示意图

46. 探针杂交示意图 检测探针 标记颜色 探针定位 IGH/CCND1 green/orange IGH: 14q32 CCND1: 11q13
合易位探针杂交后显示1R1G2F信号
细胞核IGH/CCND1双色双融合
易位探针杂交后显示2R2G信号
检测探针
标记颜色
探针定位
IGH/CCND1
green/orange
IGH: 14q32
CCND1: 11q13   
正常: 2O/2G
异常: 1O/1G/2F

47. 病例6: 393301，男，40y； 肘部肿物； IHC：CyclinD1弱阳性； 经科内会诊； FISH:21%的细胞可见融合信号；
10×
40×
病例6: ，男，40y；
肘部肿物；
IHC：CyclinD1弱阳性；
经科内会诊；
FISH:21%的细胞可见融合信号；
诊断：MCL
IHC:CyclinD1

48. 所示箭头为染色体易位
产生的融合信号（×100）

49. 病例7: 386766，女，67y 扁桃体活检2块，直径0.3CM IHC：CyclinD1弱阳性； FISH:45%的细胞可见融合信号；
10×
40×
形态不典型+IHC不理想
病例7: ，女，67y
扁桃体活检2块，直径0.3CM
IHC：CyclinD1弱阳性；
FISH:45%的细胞可见融合信号；
诊断：不排除MCL的可能，重取活检；
CyclinD1

50. 所示箭头为染色体易位产生的融合信号（×100）

52. FISH检测标本要求 新鲜活检或手术切除标本； 石蜡包埋组织或石蜡切片（3－5um）； 肿瘤穿刺活检组织或细胞涂片；
骨髓穿刺组织尽量送涂片，不用活检组织（因为脱钙需要使用盐酸，破坏DNA）；
肿瘤细胞阳性的胸腹水涂片；
一般在3个工作日后可以发出检测报告；

53. EBV-DNA定量PCR结果的稳定性分析

54. EBV-DNA定量PCR标准样品扩增曲线
107
106
105
104

55. 鼻咽癌检测结果比较 5个不同样品重复检测； 扩增可靠性99.4%； 每个样品同时进行5次重复，结果重复性很好；
同时扩增，结果存在显著差异的为8％；
不同时间扩增，结果存在显著差异的为6.7％。

56. 5个样品，每个样品分5管抽提DNA后，同时进行定量PCR检测结果
86987 ± (24%)
080716EB07
6579 ± 2729 (41%)
080716EB06
138 ± 370 (268%)
0.00
080716EB05
827.34
Final results
Quantity
Sample Name
± (14%)
080716EB09
± (10%)
080716EB08

57. × 10²
× 103
× 104
× 105
× 106

58. 5个样品，每个样品分3管，在不同时间（相隔一个星期）分别抽提DNA后，进行定量PCR检测结果

59. 5个样品，每个样品分3管，在不同时间（相隔一个星期）分别抽提DNA后，进行定量PCR检测结果
× 103
× 104
× 105
× 106

60. Thank you for your attention!!