1. Генетическая инженерия и современные стратегии создания антибиотиков
Лектор – доцент кафедры фармацевтической технологии, к.фарм.н. В.М. Воробьева

2. Технология рекомбинантных ДНК
Технология рекомбинантных ДНК
технология по соединению in vitro фрагментов ДНК с последующим введением рекомбинантных (новых) структур в живую клетку.

3. Технология рекомбинантных ДНК в производстве белковых ЛП позволяет
Решить проблему дефицита сырья
Повышать физиологическую активность биорегуляторов
Снижать вероятность побочного действия после применения

5. Этапы технологии рекомбинантных ДНК:
Получение клонируемого гена: из организма–донора нужных генов экстрагируют нативную ДНКи подвергают ее ферментативному гидролизу;
Введение клонируемого гена в вектор: клонируемую ДНК соединяют с другой ДНК (клонирующий вектор), с образованием рекомбинантной ДНК;
Перенос рекомбинантной ДНК в реципиентную клетку: рекомбинантную ДНК вводят в компетентные прокариотические или эукариотические клетки;
Идентификация клеток-реципиентов, содержащих рекомбинантную ДНК;
Получение клонируемого белка.

6. Экспрессия прокариот

7. Экспрессия эукариот

8. Методы получения клонируемого гена:
выделение гена из геномной ДНК человека с помощью рестриктаз;
Недостатки метода:
1. большинство структурных генов эукариот, в отличие от структурных генов прокариот, имеют сложное строение: состоят из дискретных кодирующих синтез белка, участков ДНК (экзонов), разделенных некодирующими участками (интронами),

9. Методы получения клонируемого гена:
Решение проблемы экспрессии генов человека в клетки прокариот возможно следующими методами:
ферментативным синтезом кДНК на основе изолированной после сплайсинга матричной РНК с помощью обратной транскриптазы ретровирусов;
химико-ферментативным синтезом с использованием ДНК-лигазы или на основе полимеразной цепной реакции.

10. Выбор метода получения клонируемой ДНК зависит от следующих факторов:
степени изученности гена, его строения и положения в геноме донора;
от уровня разработки методов выделения мРНК данного гена и методов обнаружения функциональной активности целевого продукта
существования объектов, в которых клонируемый ген находится в больших количествах или в которых нужный ген особенно активен, что позволяет выделить достаточные количества мРНК.

11. доставка клонируемого гена в реципиентную клетку осуществляется с помощью вектора
Плазмиды - трансформация
Бактериофаги - трансдукция
Вирусы – трансфекция
Космиды
фазмиды

12. Требования к продуцентам рекомбинантных белков
Полная изученность генома
Изученность метаболизма на уровне вида
Отсутствие патогенности или умеренная патогенность
Способность расти в условиях производства на экономически доступных средах

13. В качестве продуцентов рекомбинантных белков используют
Escherichia coli (кишечная палочка)
Bacillus subtilis (сенная палочка)
Pseudomonas (псевдомонады)
Сахаромицеты
- метилотрофные дрожжи Pichia pastoris
культура клеток китайского хомячка CCL-2 (CHO)

14. пекарские дрожжи - Saccaromyces cerevisiae

15. пивные дрожжи - Saccaromyces carlsbergensis

16. Биообъект является
носителем чужеродного генетического материала
продуцентом чужеродного белка

17. необходимо свести к минимуму
исключение чужеродных генов из генома
гидролиза чужеродной РНК
вероятность протеолиза клонируемого белка

18. Направления генетической модификации продуцентов
Ограничение активности внутриклеточных нуклеаз и протеаз
Обеспечение секреции белка в культуральную жидкость за счет присоединения лидерной аминокислотной последовательности
Обеспечение ауксотрофности по аминокислотам или витаминам для экологической безопасности

19. Обеспечение экологической безопасности ГМО
Технологические приемы, используемые для защиты персонала, производственного процесса, отходов и окружающей среды от контаминации клетками Escherichia col i:
В хромосому Escherichia coli вносят дефект (по синтезу витаминов или аминокислот), присутствие гена-инвалида обеспечивает размножение микроорганизма на среде, которая создается в ферментаторе, при попадании в окружающую среду такой микроорганизм погибает.

20. Обеспечение экологической безопасности ГМО
Синтез при пониженном давлении (ниже атмосферного) в системе биосинтеза, тогда в случае прорыва сети идет засасывание воздуха в систему, а не вылив содержимого в окружающую среду.
Фильтры на системах выброса.
Стерилизация ферментаторов и системы трубопровода после каждого технологического цикла.

21. Недостатки производства и применения инсулинов из животного сырья:
большой объем производства требует наличия здоровых животных;
сложность выделения, хранения и транспортировки сырья;
антигенные свойства в связи с отличием на одну аминокислоту в свином инсулине;
не достигается полная очистка от проинсулина за исключением производства высокоочищенных препаратов;
формирование инсулинорезистентности, что внешне выражается в развитии у больных липодистрофии.

22. Преимущества человеческого генно-инженерного инсулина человека:
Улучшение контроля гликемии связанное с отсутствием инактивирования инсулина под действием антител, циркулирующих в крови
Уменьшение аллергизации, так как инсулин не воспринимается как чужеродный белок.
Снижение липотрофии.
Возможность стабильного производства инсулина в неограниченном количестве.
Возможность изготовления в катриджах или пенфиллах для шприц-ручек, что позволяет больному вести активный образ жизни.

23. Основные отличия в технологии инсулинов наблюдаются
в конструировании штамма-продуцента:
- метод получения гена
- выбор вектора
- выбор реципиентных клеток
- способ доставки генетической информации
в постбиосинтетических преобразованиях целевого продукта.

24. препроинсулин Сигнальный пептид Аминокислотные цепи А и В
Соединительный пептид С

27. Расщепление бромцианом.
Ген А-цепи
Ген В-цепи
Ген в-Gal
Ген в-Gal
Плазмида
Плазмида
В-цепь
А-цепь
в-Gal
в-Gal
Лизис клеток.
Расщепление бромцианом.
очистка
А-цепь инсулина
В-цепь инсулина
Окисление
Инсулин

30. Выбор вида реципиентных клеток зависит от свойств клонируемого белка:
Выбор вида реципиентных клеток зависит от свойств клонируемого белка:
белки простой структуры могут успешно синтезировать прокариотические клетки кишечной палочки;
получение гликозилированных белков, с правильной укладкой дисульфидных связей и другими пострансляционными изменениями протеинов требуют использования в качестве рекомбинантных продуцентов эукариотических клеток дрожжей;
для более специфических модификаций протеинов применяют культуры клеток животных тканей.

31. Контроль лекарственных средств рекомбинантных белков
Контроль лекарственных средств рекомбинантных белков
описание
подлинность и чистота
биологическая активность
апирогенность
отсутствие острой и хронической токсичности
биологическая и иммунологическая тождественность, которая определяется по стандартным международным образцам, причем стандартный образец всегда используется рекомбинантный.

32. Современные технологии создания продуцентов антибиотиков

33. Традиционное определение антибиотиков
Химиотерапевтические вещества, продуцируемые микроорганизмами и избирательно подавляющие рост других микроорганизмов и опухолевых клеток

34. Современное определение антибиотиков
Низкомолекулярные биорегуляторы микробного происхождения, которые играли фундаментальную роль на ранних этапах развития жизни на Земле и являлись основными эффекторами в дорибосомальных системах матричного синтеза, в настоящее время вытеснены продуктами рибосомального синтеза (белками), но сохранили способность вмешиваться в биохимические процессы

35. Социальное значение открытия антибиотиков
Снижение смертности, особенно в детском возрасте
Уменьшение тяжести и частоты возникновения тяжелых осложнений инфекционных заболеваний и раневой инфекции
Возрастание средней продолжительности жизни

36. Особенности антибиотиков
Избирательность действия на метаболизм микробной клетки
Действие на микроорганизм в условиях макроорганизма

37. антибиотик Антимикробный побочное Эффект действие
Антимикробный побочное
Эффект действие
Резистентность метаболизм
инфицирование
Микроорганизм Макроорганизм
иммунная защита

38. Пути получения антибиотиков
Биосинтетический
Полусинтетический
Синтетический

39. Продуценты антибиотиков
Плесневые грибы Penicillium и Acremonium, Fusidium,Tolypocladium
Актиномицеты Streptomyces
Почвенные споровые бактерии Bacillus

40. Биологическая роль антибиотиков
Средства преодоления стрессовых ситуаций для продуцента
Уничтожение микроорганизмов, конкурирующих с продуцентом за питательные вещества
Эффекторы дифференциации мицелия или спорообразования

41. Общие механизмы защиты продуцентов от suicide
Максимум концентрации антибиотиков достигается после завершения роста культуры
Компартментализация
Транспорт антибиотика из клетки в одностороннем направлении из клетки

42. Специфические механизмы защиты продуцентов от suicide
продуценты
Механизм защиты
Аминогликозидов
Временная ферментативная инактивация антибиотика при участии трансфераз
Макролидов (эритромицина)
Изменение конформации таргета в результате метилирования 50S рибосомы
В-лактамных антибиотиков
Отсутствие мишени действия – пептидогликана в клетках плесневых грибов

43. Технологии создания продуцентов
Ненаправленный скрининг (Пенициллин)
Направленный скрининг
Индуцированный мутагенез
Слияние протопластов
Таргетный скрининг ( на основе открытий геномики, протеомики и использовании биоинформатики)

44. Проблемы использования технологии рекомбинантных ДНК
Антибиотики не являются прямыми продуктами трансляции. Прямыми продуктами трансляции являются ферменты биосинтеза антибиотиков.
В биосинтезе молекулы антибиотика принимают участие десятки структурных генов, необходимость манипулировать большим количеством генов, контролировать их функции существенно усложняет исследования.

45. ХХ век Случайное открытие
Оценка специфической активности и механизма действия
Клинические испытания
Медицинское применение

46. ХХI век Сравнение генома человека и патогена
Поиск специфических генов-мишеней у патогена
Выявление структуры белка-мишени (таргета)
Поиск ингибиторов репликации гена или активности таргета
Подтверждение специфической активности
Клинические испытания
Медицинское применение

47. Геномика -
Новое научное направление, объектом изучения которого являются геномы всех организмов
Основной метод- секвенирование

48. Направления геномики -
Структурная геномика – содержание и организация генетической информации
Функциональная геномика – реализация информации, записанной в геноме от гена к признаку.
Сравнительная геномика – сравнительное изучение содержания и организации геномов разных организмов

49. Протеомика -
Изучает совокупности структурных и каталитических белков в клетках прокариот и эукариот методом двухмерного электрофореза (по молекулярной массе и изоэлектрической точке)
Позволяет следить за белковыми взаимодействиями
Базируется на функциональной геномике
Является этапом познания живого мира на белковом уровне

50. Биоинформатика-
Область науки, разрабатывающая и применяющая вычислительные алгоритмы для анализа и систематизации генетической информации с целью выяснения структуры и функции макромолекул с последующим использованием этих знаний для создания новых лекарственных средств

51. Таргет – внутриклеточная мишень белковой природы
Антибиотики
Таргеты
В-лактамные
Транспептидазы пептидогликана
Аминогликозиды, тетрациклины
Макролиды
Белки 30 S рибосомы
Белки 50 S рибосомы
Фторхинолоны
ДНК-гираза
Рифампицин
РНК-полимераза

52. Перспективный ген патогена должен отвечать требованиям
Отсутствие аналогичной нуклеотидной последовательности в геноме человека
существенность гена для жизнедеятельности патогена

53. Сравнение геномов человека и патогена проводят методом биоинформатики
Сравнение геномов человека и патогена проводят методом биоинформатики

54. существенность гена для жизнедеятельности патогена
Определяют на основе экспрессии гена в живом организме.
Геномика выделяет в патогенном организме гены
House keeping – домашнего содержания
Ivi - вирулентности

55. К ivi генам относятся гены патогена
Существенность которых проявляется в инфицированном организме
Кодирующие
образование токсинов
Системы выживания в условиях неспецифического иммунитета организма хозяина
Системы жизнеобеспечения в условиях дефицита метаболитов и неорганических ионов в тканях организма хозяина

56. Существенность (значимость) гена для патогена возможно несколькими методами, но для большинства лабораторий применим метод IVET
Метод IVET (In vivo expression technology) основан на захвате промотора и использовании целостного живого организма или культуры животных клеток как селективной среды, выявляющей экспрессию ivi генов.

58. Этапы метода IVET фрагментирование генома патогена
трансформация бактериальных клеток
селекция in vivo
селекция in vitro

59. Таргетный скрининг

60. Этапы таргетного скрининга
Выбор гена патогенного организма
Амплификация гена методом ПЦР и получение таргета в безклеточной рибосомально-матричной системе
Определение специфической активности таргета бесклеточной системе
Выбор антимикробного агента с высокой аффинностью к таргету
Исследование механизма взаимодействия антимикробного агента с целой микробной клеткой

61. Исследование взаимодействия антибиотика и клетки патогена необходимо, потому что
Антибиотик может не проникать в клетку,
Антибиотик может подвергаться ферментативной инактивации
Антибиотик будет вступать во взаимодействие с другими макромолекулами клетки
Патоген закроет доступ антибиотика к таргету