1. טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

2. תאי גזע עובריים בתרבית עכבר – 1981 אדם – 1998 המאפיינים העיקריים של תאי גזע עובריים :  התחדשות עצמית בלתי מוגבלת  פלוריפוטנטיות

3. תנאים בסיסים למחקר בתאי גזע עובריים שליטה על גדילת התאים במצב בלתי ממוין בתרבית יכולת השריית התמיינות ספציפית על התאים תאי גזע עובריים

4. גידול בתרבית - גופיפים עובריים הזרקה לעכברים - טרטומות תאי גזע עובריים לא ממוינים התמיינות סטוכסטית אנדודרם מזודרם אקטודרם התמיינות תאי גזע עובריים

5. תאי גזע עובריים לא ממוינים אקטודרם התמיינות מושרה אנדודרם הנדסה גנטית הוספת פקטורים ספציפים לתרבית

6. תכנות מחדש (reprogramming) של תאים סומאטיים “The reversal of the differentiation state of a mature cell to one that is characteristic of the undifferentiated embryonic state” Gurdon, 1962

7. שיבוט למטרת ריפוי Therapeutic Cloning Gene & cell therapy Cloning ES cells isolation

8. הפריית מבחנה בלסטוציסט בידוד תאי המסה הפנימית גידול בתנאים מתאימים ליצירת תאי גזע עובריים שיבוט שיבוט למטרות ריפוי לעומת שיבוט למטרות רבייה לא באדם!

9. cloning First somatic cloning in mammals Wilmut I. et al, Nature, 1997 Lamb 6LL3 - Dolly כבשה 1996

10. מינים משובטים עכבר 1996 עז 1999 פרה 1998 חזיר 2000 חתול 2002 zebra-fish 2002 ארנב 2002 פרד 2003 סוס 2003 כלב 2005 חולדה 2003

11. שיבוט בבני אדם Science. 2005 Jun 17;308(5729):1777 Science. 2004 Mar 12;303(5664):1669

12. מאמר הבית William M. Rideout, III 6,, 1, Konrad Hochedlinger 6,, 1,, 2, Michael Kyba 6,, 1, George Q. Daley 1, 3 and Rudolf Jaenisch,, 1, 4616126 1 3 14

13. עכברי Rag2 -/- ללא האנזים, recombinase RAG2, לא מתבצע ה -VDJ rearrangement. עכברי RAG2 -/- הם עכברי SCID, ללא תאי T תאי B. בתנאים סטריליים העכברים חיים בצורה נורמאלית ניתן לתקן את מערכת החיסון של העכברים ע " י הזרקת תאי גזע המטופואטים מעכברי WT

14. Proof of principle for therapeutic cloning combined with gene therapy

15. Tetraploid embryo complementation two cell embryos (diploid)one cell embryos (teraploid) teraploid blastocysts injection of ES cells Eakin GS et al. Dev Dyn. 2003; 228: 751 electrofusion

16. ההוכחה שתאי ntES הם אכן פלוריפוטנטים Tetraploid embryo complementation העובר נוצר מתאי ה -ES והתאים הטטרפלואידים תורמים ליצירת השלייה. הצליחו לקבל 4 עכברונים חיים 28% (4/14)

17. תיקון המוטציה ב-RAG2 ע"י רקומבינציה הומולוגית האלל המוטנטי, מכיל מחדר בתוך אקסון 3 הקונסטרוקט לצורך תיקון המוטציה תוצר הרקומבינציה ההומולוגית האלל המתוקן לאחר הוצאת סמן הסלקציה Rag2 +R/- LoxP

18. האלל המתוקן (Rag2 +R/- ) יוצר מערכת חיסון תקינה Tetraploid embryo complementation  הזרקת תאי ntES Rag2 +R/- אנליזת PCR לזיהוי rearrangements בתאי B ותאי T אנליזת FACS עם נוגדנים כנגד תאי B ותאי T

19. האלל המתוקן (Rag2 +R/- ) יוצר מערכת חיסון תקינה בעכברי Rag2 -/- - תיקון in-vivo שימוש בעכברי Rag2 +R/- כתורמים של HSC (Hematopoietic stem cells) לעכברי Rag2 -/- – אנליזת FACS עם נוגדנים כנגד תאי B ותאי T ntES cells " מתוקנים " מעכברי Rag2 -/- יכולים ליצור תאי מח עצם נורמאלים.

20. Repaired ntES EB s hematopoietic stem cells Hematopoietic cytokines HOXB4 GFP Rag2 -/- WT השריית התמיינות in vitro על תאי ntES והשתלתם בעכברי Rag2 -/- 6 ימים 14 ימים

21. מדוע התאים נדחו בעכברי Rag2 -/- ? העמידות כנגד ההשתלה היא תכונה ספציפית של עכברי ה Rag2 -/- התאים מבטאים רמה נמוכה של MHC תאי NK הורגים תאים המבטאים רמה נמוכה של MHC יתכן שעכברי Rag2 -/- מבטאים רמה גבוהה של NK cells

22. האם הדחייה נובעת מתגובה של תאי NK? השתלת התאים לעכברים ללא תאי NK hematopoietic stem cells Rag2 -/-,  C null Rag2 +/- ES

23. תוצאות ההשתלה בעכברי Rag2 -/-,γC null התאים לא נדחו  95 % מהתאים בדם הפריפרי ביטאו GFP בעיקר תאים מילואידים ( גרנולוציטים ) וכמות קטנה מאד של תאי B ותאי T תאי B תאי Tגרנולוציטים

24. סיכום NK-/- 1)VDJ recombination restored 2)Low level of T/B cells in blood. 3)High level of granulocytes.

25. סיכום ומסקנות מטרת העבודה – תיקון פגמים גנטים בעכבר ע " י שילוב של "therapeutic cloning" ו gene therapy פעילות האנזים Rag2 משוחזרת בתאי ntES מוטנטים שתוקנו ע " י רקומבינציה הומולוגית התקבל שחזור מסויים של מערכת החיסון בעכברי ה - SCID שתי בעיות עיקריות : – דחייה ע " י NK cells – התמיינות לימפואידית נמוכה ביותר יתכן שזה נובע מביטוי של HoxB4 ש " דוחף " לכיוון התמיינות מילואידית פרוטוקולים משופרים של התמיינות יפתרו כנראה את הבעיה.

26. אסטרטגיות שונות " לתכנת מחדש " תאים Jaenisch R & Young R., Cell 2008

27. תכנות מחדש ע " י הדבקה רטרו - ויראלית של פקטורים ידועים (iPS-induced pluripotent stem cells) Jaenisch R & Young R., Cell 2008

28. Morphological Changes Following Infection with the 4 Factors WT-MEFs Morphological changes (Day 7) mIPS colonies at Day>20 Mouse iPS- First reported 2006 FibroblastsHuman iPS Human iPS- First reported December 2007

29. טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של “" תכנות מחדש " (iPS) וריפוי גני : החזון והמציאות

30. Treating Sickle-Cell Anemia with iPS Cells Hanna J et al., Science 2007 The future? L.C

31. שבוע הבא- הרצאה של יעקוב ביום שני|(29.12.08) בשעה שתיים בחדר סמינרים- מומלץ!