1. Received 15 June 2005; revised 12 September 2005; accepted 7 October 2005 Effects of dissociated glucocorticoids on OPG and RANKL in osteoblastic cells E.L. Humphrey a, J.H.H. Williams a,b, M.W.J. Davie a, M.J. Marshall a, 姓名 : 萬映汝 系級 : 生物科技學系四年級 學號 :91390496

2. Abbreviation GIOP- GIOP- glucocorticoid-induced osteoporosis GR- glucocorticoid receptor hFOB- human fetal osteoblast nGRE- negative glucocorticoid response element OPG- osteoprotegerin 促骨生成蛋白受體為蝕骨 細胞分化抑制因子 RANKL- receptor activator of nuclear factor kappa B ligand 促骨生成蛋白結合子為促進蝕骨 細胞生成的主因子

3. Introduction Glucocorticoid treatment often leads to unwanted side effects including weight gain, skin thinning, osteopenia, eye defects, depression, diabetes, adrenal insufficiency and peptic ulcers ， 但長期使 用 Glucocorticoid 治療會導致 GIOP. Adult bone remodeling is carried out by osteoblasts and osteoclasts, which are controlled by various hormones, cytokines and growth factors.

4. 骨骼新陳代謝動態之平衡 造骨速率與蝕骨速率相當 骨骼新陳代謝動態之平衡 造骨速率與蝕骨速率相當

5. 骨骼新陳代謝正常狀況

6. hormonal 和 cytokine 會調控造骨細胞產生 RANKL 的 可溶性 cytokine ，會跟蝕骨細胞上的 RANK receptor 鍵結或是跟它的 precursor, 刺激骨骼的再吸收 造骨細胞會產生 OPG, 跟 RANKL binding 阻止與 RANK receptor 鍵結來抑制蝕骨細胞的生成 GR 與 nGRE 結合會抑制基因轉錄及物理性阻斷轉 錄機制運行，或阻斷一正向調控的轉錄因子去跟 它的 response element 結合使基因轉錄被抑制  cis- repression

7. Actived GR 可抑制一持續性的活化，或抑制具誘 導性的轉錄因子，利用 protein-protein 的交互作用 不需與 DNA binding 來防止 activating 基因轉錄  trans-repression Ligand 與 GR 鍵結造成 receptor 構型改變 transrepress 基因轉錄，但有較少甚至無 transactivation 活性  dissociated glucocorticoid (symmetrical glucocorticoid 則會造成 GR 的 transactivation 及 transrepression) 結果顯示 dissociated glucocorticoid 及 deflazacort 較 symmetrical glucocorticoid prednisolone 對 RANKL 的 活化作用低，且在某些情況下較無法抑制 OPG 製 造

8. 實驗方法細胞培養 MG63cell(European collection of cell cultures) 培養在 α-minimal essential media (αMEM) at 37°C +10% 胎牛血清 + +100 IU/ml 苯甲基青黴素 + + 100μg/ml 鏈黴素 +2 mM L-glutamine 在含有 5 %carbon dioxide 潮濕的環境下培養

9. 人類胚胎造骨細胞 hFOB cells 培養在 DMEM/HAMs F12 medium +10% 胎牛血清 + +100 IU/ml 苯甲基青黴素 + + 100μg/ml 鏈黴素 +2 mM L-glutamine +0.3mg +0.3mg/ml geneticin 在潮濕環境 33.5°C 下培養 7 天 - 細胞增生 39.5°C2 天 - 細胞分化

10. Both cell types were seeded in 96-well plates at 2.8 × 10−3 cells/cm2for OPG protein determination 24-well plates for total RNA extraction after 48h and stored at −20°C for OPG measurements 加入 Tetrazolium (MTS 190 μg/ml) 及 phenazine ethosulphate (PES 30 μM) 溶液到毎個 well 作用 30min

11. OPG ELISA 用 用 goat anti-human OPG capture antibody Captured OPG was detected with biotinylated anti-OPG antibody 用 10% sulphuric acid 停止反應 用 Dynatech Microtitre plate reader 用 Sigma plot software

12. RNA extraction and first strand cDNA synthesis Qiagen RNeasy kit Real-time PCR 利用 利用 the ABI Assays on Demand primers and Taqman universal PCR master mix

13. 在 MG63 cell 中 dexamethasone 抑制效果最佳

14. 在 hFOB cell 中 dexamethasone 抑制效果最佳

15. The potency of each GR ligand is described by its IC50, and its effectiveness is described by the maximum inhibition. 10 倍 6倍6倍6倍6倍 12 倍 達最大抑制 OPG 產量 一半所需的化合物濃度

16. 在 MG63cell 中加入 10μM 的 anti-glucocorticoid RU486 OPG 濃度皆提高

17. control 為 anti-glucocorticoid control RU43044 ( in MG63 cell )

18. control 為 anti-glucocorticoid control RU43044 (in hFOB cell )

19. control 為 inactive racemer AL438-F2 ( in MG63 cell )

20. control 為 inactive racemer AL438-F2 ( in hFOB cell )

21. 三個 RU compond 的 抑制能力及最大抑 制效果相近，但較 prednisolone 低 AL438-F1 及 ZK216348 抑制效能 力低近 50 %

22. Effect of Glucocorticoids on OPG and RANKL expression

23. hFOB cell 內 OPG 與 RANKL 訊息的相對調控 造成的 message 比例 Prednisolone 因為對 OPG 抑制效果佳 Prednisolone 因為對 OPG 抑制效果佳所以相對比值就較高

24. Discussion Glucocorticoid 會刺激蝕骨細胞分化，藉由直接增強 RANKL 訊號，間接抑制 INF-β 的產生，並刺激造骨細胞 產生 RANKL 抑制產生 OPG ，以利蝕骨細胞的生成及骨 骼的再吸收能力上升 Deflazacort 相較於 prednisolone 對造骨細胞 OPG 抑制能力 低 10 倍，但在高濃度下兩者效果相當，且 Deflazacort 對 RANKL 的刺激能力低於 prednisolone ( 都是由類固醇的 GR ligand ； deflazacort 被視為 ” bone sparing ” Glucocorticoid) dissociated glucocorticoid 屬非類固醇的 GR ligand ，仍具有 抗炎的活性但呈現較少的 transactivation 的活性

25. dissociated glucocorticoid AL438 對 MG63cell 的 OPG 產 生及骨鈣蛋白質 ( 視為是骨骼形成及造骨功能的 marker ， prednisolone 會抑制它的產生 ) 產生的抑制較 prednisolone 弱 所有活化的 dissociated glucocorticoid 對造骨細胞 OPG 產生的抑制能力都較 prednisolone 低；所有的高濃度 的 RU compounds 對 OPG 的抑制效果和 prednisolone 相 當 AL438-F1 和 ZK21648 在 hFOB 、 MG63 cell 中對 OPG 抑 制效果明顯低於 prednisolone 近來發現 GR 會藉由招集不同 co-regulator 對基因產生 不同的影響，因為 GR 的 ligand binding domain 有一個 高度保留且含有 glutamate 及 lysine residues 的序列  charge clamp

26. charge clamp 可與 GR 的 co-regulator 鍵結，當被 GR ligand binding 改變結構使基因轉錄被抑制 AL438 不與 co-activator PGC-1 反應，但 prednisolone 會 (PGC-1 牽涉到 glucocorticoid 對肝臟 glucose 產量的 調控 ) ，因此相較於 prednisolone 可導致較少的血糖 過高問題 利用 GR ligand 這種 co-regulator 去改變 GR 的結構使 不會刺激 RANKL 的表現及抑制 OPG 的產生，因 此不會刺激骨骼的再吸收，降低骨質疏鬆的風險 利用 GR ligand 這種 co-regulator 去改變 GR 的結構使 不會刺激 RANKL 的表現及抑制 OPG 的產生，因 此不會刺激骨骼的再吸收，降低骨質疏鬆的風險