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課堂內容 蛋白質 (protein) 蛋白質純化 學生 : 陳建良 2004.11.02
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The construction of cells DNA or RNA Protein Carbohydrates Lipid etc.
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Peptide bond
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Isoelectric point of protein (PI) PI=(pK 1 +pK 2 ) / 2 pH < pI positive charge pH > pI negative charge
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蛋白質結構
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Major biological functions of protein Catalytic proteins: A+B C Structural proteins Transport proteins Regulatory proteins Protective proteins : antibodies enzyme
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蛋白質的沈澱作用 能使蛋白質發生沈澱作用的因素有: 酸 酸性試劑 單寧酸 重金屬離子(汞離子、鉛離子等) 咖啡因 嗎啡 中性鹽 有機溶媒 熱
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蛋白質的溶解度 1.pH 值:當 pH 值在其等電點( pI )時,溶解度 最小。 2. 鹽濃度:當在低濃度時,蛋白質的溶解度隨 著鹽濃度的增加而增加,稱為 Salting-in 。當 鹽濃度高至某一濃度時,蛋白質的溶解度隨 著鹽濃度的增加而減少,稱為 Salting-out 。 3. 溶媒的介電常數( Dielectric contant ):酒精、 丙酮的常數較水小,使蛋白質分子在此溶媒 中的斥力較小,溶解度較低。 4. 溫度:在一限定的溫度(約 0~40 ℃)下,大 部份的蛋白質溶解度隨溫度的上升而增加。
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蛋白質純化 鹽析 (salting out) 等電點沉澱 (Isoelectric focusing) 離子交換層析法 (ion exchange chromatography) 膠體過濾層析法 (gel filtration chromatography) 親合力層析法 (affinity chromatography) 透析 (dialysis)
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等電點沉澱 pH=PI 淨電荷為零, 溶解度最小 沉澱
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Ion exchange chromatography R + A - + B - R + B - + A - 原理是依據物質 所帶陰陽離子的 不同。電荷不同 的物質,對管柱 上的離子交換劑 有不同的親和力, 改變沖洗液的離 子強度和 pH 值, 物質就能依次從 層析柱中分離出 來
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Gel filtration chromatography
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Affinity chromatography 利用生物專一性, 特定蛋白質 僅與特定受質 (substrate) 作結 合
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Dialysis Cellophane nitrocellulose collodion
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