1. Isolation and Characterization of Bacteria Producing Substances Against Gram Positive Bacteria 報告學生：鄭燕如 張如慧 報告日期： 2003/12/29

2. 前言 I 在世界各地，從醫院內部感染的個案中， 革蘭氏陽性細菌，是引起醫院內部感染 的最大來源。 人類疾病中，多為革蘭氏陽性球菌及革 蘭氏陽性桿菌。

3. 前言 II 革蘭氏陽性桿菌在一般人體正常菌叢中 較不常見，但其所具有的致病毒性卻相 當強，會引起一些致命的疾病，如白喉 （由白喉桿菌所引起）或敗血病及細菌 性腦膜炎（列氏桿菌屬）。 要治療這些疾病，就必須抑制這類病原 菌的生長。

4. 前言 III 利用微生物代謝物中的某些物質（抗生 素），來殺死其他微生物或抑制其他微 生物繁殖，作用機轉可分為 : 1. 抑制細胞壁的合成 2. 破壞細胞膜 3. 抑制蛋白質的合成 4. 影響它的去氧核糖核酸的合成

5. 目的 自土壤中分離出會利用代謝產物來抑制革 蘭氏陽性菌（ gram positive ）的細菌

6. 材料 I 第四組及淡水的土樣 革蘭氏陽性菌株 Bacillus cereus Staphylococcus aureus subsp. aureus 9mL 0.85% NaCl 、 100 ppm cycloheximide 2,5,7,10%NaCl glucose 、 xylose 、 mannitol 、 lactose 、 fructose 、 arabinose

7. 材料 II Citrate Urea broth MacConkey agar Mannitol Salt Agar SIM agar Voges-Proskauer 1/3TSA

8. 實驗流程 自土壤中分離出菌株做純培養 ↓ 與革蘭氏陽性菌做拮抗測試 ↓ 挑選出具有拮抗作用的菌株 ↓ 利用傳統方法進行菌株的鑑定

9. 實驗流程 -I 1g 土樣 +9mL 0.85% NaCl 連續稀釋至 10 4 ↓ 取稀釋度 10 3 、 10 4 0.1mL 塗抹於含 100ppm cycloheximide 的 1/3TSA( 二重複 ) ↓ 30 ℃ ‚ 培養 ↓ 待菌落長出 ‚ 四區畫線純培養於 1/3TSA 上

10. 實驗流程 -II 篩到的菌株 ↓ 將革蘭氏陽性菌利用無菌棉棒接種 到 0.85% NaCl 中 ‚ 再塗抹至 1/3TSA plate 上 ↓ 利用 loop 將分離出來的細菌接種到 已塗有革蘭氏陽性菌的 plate 上 ↓ 培養 30 ℃、一天，觀察拮抗現象 a 1 a 2 a 3 a 4

11. 實驗流程 -III Gram stain Spore stain Carbohydrate fermentation 2,5,7,10%NaCl Citrate uilization test Urease test MacConkey agar Mannitol Salt Agar

12. 實驗流程 -IV Nitrate reduction test Catalase test Oxidase test Voges-Proskauer test Indole production test Triple sugar-iron agar test SIM agar

13. 結果與討論 I 篩出五株菌對所測試的 Bacillus cereus 和 Staphylococcus aureus subsp. aureus 皆具 有拮抗作用 ‚ 編號為 a3 ‚ a6 ‚ b1 ‚ b2 及 d3 此五株菌在醣類發酵的測試中皆沒有氣 體的產生 ‚ 故推論不是兼性厭氧的菌。

14. 結果與討論 II 由革蘭氏染色得知 a3 與 a6 為革蘭氏陰性 桿菌 ‚ 而 b1 ‚ b2 與 d3 為革蘭氏陽性桿菌 。 由孢子染色得知 b1 ‚ b2 與 d3 具有孢子 ‚ 但 是孢子位置不確定 ‚ 可能位於細胞中間或 細胞頂端。

15. 結果與討論 III 由表一的生化測試中看到 ‚a3 與 a6 的生化 測試幾乎完全一樣 ‚ 只在測其移動性時 a3 具有明顯的移動性 ‚ 而 a6 則沒有 ; 但其實在 觀察時 a6 感覺具有很不明顯的移動性。 (a3 與 a6 請看分類樹一.)

16. 結果與討論 IV 由生化測試中看出 b1 、 b2 、 d3 皆為產孢 的桿菌，且 catalase 反應皆為正，由此可 得知此三株菌皆為 Bacillus spp. 而 b1 、 b2 、 d3 的生化測試中只有 glucose 發酵測試、 citrate 、 mannitol 的結果反應 不大相同，其它的生化測試皆相同 （分類樹二）

17. 分類樹一. G(-) ‚rod 且 catalase test 為正反應 Bdellovibio spp. Azospivillum spp. Halobacterium spp. Acetobacter spp. Legionella spp.

18. 分類樹一. (+) Oxidase Bdellovibio spp. Azospirillum spp. Halobacterium spp. Legionella spp. Urease Acetobacter spp. Legionella spp. (－)(－)

19. 分類樹一 urease Bdellovibio spp. Acetobacter spp. Legionella spp （＋） （－） Glucose fermentation Bdellovibio spp. Azospivillum spp. Halobacterium spp. Acetobacter spp.

20. 分類樹一 Bdellovibio spp. Glucose fermentation H. volcanii H. saccharovorum H.vallismortis Acetobacter paseurianus A. aceti A. liquefocieus A. hansenii

21. 分類樹一 Nitrate reduction （＋）（－） H. saccharovorum H.vallismortis A. aceti A. liquefocieus H. volcanii 外觀形態

22. 分類樹一 Pale color A. aceti 較無移動性 (a 6 ) A. liquefocieus 較具移動性 (a 3 ) Paink color H. volcanii

23. 分類樹二 Bacillus spp. Sporolactobacillus spp. Clostridum spp. Desulfotomaculum spp. Oscillospira spp. Sporosarcina spp. Planococcus spp. Lactobacillus spp. Kurthia spp. Endospore-rod （＋）（－）

24. 分類樹二 Bacillus spp. Sporolactobacillus spp. Clostridum spp. Desulfotomaculum spp. Oscillospira spp. catalase （＋）（－）

25. 分類樹二 B. alcalophilus B. circulans B. lentus B. macerans B. macquarinsis B. marinus B. megaterium B. thuringiensis B. brevis B. globisporus B. sphaericus B. insolitus B. laterosporus B. pantothrnticus B. firmus B. schlegelii B. stearothermophilus xylose （＋） （－）

26. 分類樹二 B. Megaterium B. Sphaericus B. Stearothermophilus B. thuringiensis B. Brevis B. Insolitus B. Laterosporus B. Marinus （＋） （－） citrate B. Pantothrnticus B. schlegelii B. sphaericus b1 d3b2 glucose （＋） b1 （－） d3 glucose （－） b2

27. 分類樹二 B. Megaterium B. Sphaericus B. Stearothermophilus B. thuringiensis B. Insolitus B. schlegelii glucose （＋） glucose （＋） （－） b1b2d3

28. 表一. 生化測試 -I 測試項目 a 3 a 6 b 1 b 2 d 3 glucose ＋ ＋ ＋ － － （ gas ） － － － － － xylose ＋ ＋ － － － （ gas ） － － － － － 2 ﹪ NaCl ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 5 ﹪ NaCl ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 7 ﹪ NaCl ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 10 ﹪ NaCl s s s s － S ：長很慢

29. 表二. 生化測試 -II 測試項目 a 3 a 6 b 1 b 2 d 3 citrate ＋ ＋ ＋ － ＋ mannitol － － － ＋ ＋ lactose － － － － － fructose ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ arabinose － － － － － urea broth － － － － －

30. 表三. 生化測試 -III 測試項目 a 3 a 6 b 1 b 2 d 3 MCA ＋ ＋ － － － MSA － － ＋ ＋ ＋ SIM － － － － － （ indole ） ＋ － － － － TSIA － － ＋ ＋ ＋ VP － － － － － Oxidase ＋ ＋ － － － Catalase ＋ ＋ ＋ ＋ ＋

31. Gram stain a3 G(-) a6 G(-) b1 G(+) b2 G(+)

32. Gram stain Spore stain d3 G(+) d3

33. Spore stain a3a6

34. Spore stain b1b2

35. MSA test

36. 參考文獻 Bergey‘s manual of systematic bacteriology volume 1 Bergey‘s manual of systematic bacteriology volume 2