1. Isolation and Characterization of Trichoderma spp. 學生 : 陳維娜 林柏緯

2. 前言 棲地 : 森林及農業用地 為 Hypocrea 屬的無性世代 腐生真菌 ; 有時可寄生於其他真菌 具有強烈的纖維素分解酵素 (cellulase) 常見於植物根部 作為生物防治劑 (biocontrol agent)

3. 功用 Foods and textiles (cellulase 及 other enzymes that degrade complex polysaccharides) Biocontrol agents Plant growth promotion (increase the rate of plant growth and development) As a source of transgenes.

4. General characteristic 1. 快速生長 :25-30° C, 35° C 不長 2.cornmeal dextrose agar (CMD) : 透明 3. richer media such potato (PDA): 白色 4.Mycelium:CMD 上不可見 5.Conidia: 一週內生成, 叢聚, 綠色或黃色白色 較少 6. 分泌黃色素於 agar 中 ( 特別 PDA) 7. 具有甜味或椰子氣味 (some species)

5. General characteristic Conidiophore 1. 有大量的分支 並且成同心圓狀 具少量氣 生菌絲 2. 主分生胞子梗會產生成對 (or not) 的側枝 3. 分生的側枝會再分枝 並且二級的分支 通 常會成對出現 4. 最長的二級分支會最接近主軸

6. General characteristic Conidiophore 5. 一級與二級的分支 會與主軸成約 90° 6. 成對的分支 外觀為錐狀 7. 典型的分生胞子梗尾端會接著一至數個 phialides 8. 主軸的寬度 約與 phialides 的基部同寬或略 大

7. General characteristic Conidia 1. 一般為乾燥顆粒 但在有些種會成綠色或 黃色水滴狀 2. 多為橢圓形 (ellipsoidal),3-5 x 2-4 µm (L/W = > 1.3) 3. 球狀較少 (globose conidia) (L/W < 1.3) 4. 表面平順光滑 ( 多 ); 有小疣起 ( 少 )

8. General characteristic Phialide 1. 典型於中部隆起 呈圓柱狀或接近球型 2. 通常會多個叢聚於主軸上或單獨存在 3.phialide 間會成 90°

9. General characteristic Chlamydospore 1. 所有 species 皆產生 但並非皆能在 CMA 20° C 下 10 天內產生 2. 一般為單細胞球狀 產於短菌絲尾端 或產於 菌絲細胞內

10. 實驗目的 學習並了解 Trichoderma spp. 的基本生理 特徵 並且探討其對植物根部真菌病害的 抑制能力

11. 流程圖 土樣 可能菌種分離 純化 形態觀察 判定是否為 Trichoderma spp. Cellulase 降解能力測試 結抗作用測試

12. 菌種的分離及判定 1g 的土樣加入 9ml 無菌的 0.85 ﹪ NaCl 混勻 10 倍連續稀釋 6 個稀釋度 取 2 、 3 、 4 管 0.1mL 加入選擇性培養基 PDA 與 MRA 中 塗抹平板 室溫培養 將外觀與前言中描述相同者 挑出 接至 PDA 中 連續繼代培養至純菌 鏡檢觀察菌落外觀 顏色 氣味 等特徵

13. 菌種分離及判定 Potato dextrose agar : 加入 triton X-100 調至最終濃度為 1mg/mL Martin, s rose bengal agar: 加入 streptomycin sulfate 調至最終濃度 100mg /L

14. 抗真菌能力測試 將各菌株分別養在 100ml PDB 中 20 ℃ 10 天 以 0.22mm 的 filter 過濾 medium 取 0.2ml 過濾液 加入 45 ºC 25ml 1/4 strength PDA 中 混勻 加入 petri dishes mycelial discs of the pathogen(7 mm diameter) 放於 dish 上 20 ºC. 培養 ６ days 紀錄其生長直徑 ３重複

15. 圖一. 分離株 11-2 之分生孢子柄特徵

16. 圖二. 分離株 12-1 之分生孢子柄特徵

17. 圖三. 分離株 13-3 之分生孢子柄特徵

18. 圖四. 分離株 21-1 之分生孢子柄及分生孢子

19. 圖五. 分離株 23-1 之分生孢子柄及分生孢子

20. 圖六. 分離株 31-1 之分生孢子柄及分生孢子

21. 圖七. 分離株 98-1 之分生孢子柄及分生孢子

22. 黃色素的分泌

23. 圖八. 在平板上培養出現同心圓的情形

24. 圖九. 培養基影響其生長情形

25. 菌 株 代 碼 特 徵 11-212-113-321-123-131-298-1 黃色色素沉澱 (PDA) NoYesNo 氣味 ( 甜 / 椰子味 ) 甜甜甜椰子味甜甜 ( 刺鼻 ) 甜 同心圓生成 yes 菌落顏色改變白  黃綠白綠白綠 白綠白綠白綠白綠白綠白綠白綠白綠 胞子顏色 (PDA, light) 黃黃黃黃黃綠黃 PDA 上 30 ℃黑暗 培養 ( 直徑， CM) 8.8 PDA 上 35 ℃黑暗 培養 ( 直徑， CM) 6.78.86.57 8.8 Conidia length (um) 1.5231.721.52 Conidia wide (um) 11.5311.611.5 Ratio(l/w)1.51.311.71.251.51.3 Phialide 中間彭 大 Yes Phialide 全長 103948ND3 Phialide 中間寬 度 3131.44ND1 Pialide 基部寬度 20.52.512ND0.3 菌絲分隔 Yes 菌絲成直角 Yes 表一. 所分離之 Trichoderma spp. 菌株之特徵

26. 表二. 美國農業局鑑定用網站，所鑑定出的可能菌種。 菌 株 代 碼 可能的種 11-212-113-321-123-131-298-1 FIRST T. harzianum T. virens( 色 素 ONLY) T. harzianumT. strigosu m( 氣味 ) T. aggressi vum T. harzianu m(CONI DIA) T. harzianu m( 短胞子 較可能 ) SECOND T. saturnisporu m (PHIALIDE) T. atrovirid e( 較可能 CONIDIA) T. longibra chiatum( 較可能 ) T. longibra chiatum( 長胞子 ) THIRD T. virens( 色素 ) T. hamatu m T. saturnis porum( 胞子有突 起 ) T. saturnis porum( 胞子突起 ) FORTH T. virens(C OLOR) 表二. 美國農業局鑑定用網站，所鑑定出的可能菌種。

27. 結果 從 36 個樣本中所分離到菌中 有 7 株屬於 Trichoderma 屬 而 7 株 Trichoderma spp. 中 12-1 可以確定為 T. virens 21-1 可以確定為 T. strigosum 而其餘 5 株 的可能菌種如表二 所分離到的 7 株 Trichoderma spp. 其基本型態特 徵可見表一 由表一所見 可知 PDA 上 30 ℃黑暗培養的生長 速度高於 35 ℃者 。

28. 討論 1. Trichoderma spp. 之純化：單孢子純化法或 菌絲頂端純化法 2. 同心圓的形成 3. 溫度對生長的影響 (PDA 30 ℃ 或 35 ℃黑暗培養 之差異 )

29. Reference 1. 東吳大學生態實驗講義 p6-9 2. 美國農業發展局網頁 http://nt.arsgrin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaInd ex.cfm http://nt.arsgrin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaInd ex.cfm 3.Graduate School of Natural and Applied Sciences, Anadolu University 26470 Eskiflehir,Isolation of TrichodermaSpp. and Determination of Their Antifungal, Biochemical and Physiological Features,Turk J Biol 27 (2003) 247-253,