1. 实验 19 花粉生活力测定 一、目的 学习和初步掌握稻、麦或棉的花粉生活力测 定方法。

2. 实验 19 花粉生活力测定 二、内容说明 作物杂交工作中，往往会遇到父母本花期 不遇，必须采集花粉短暂贮藏，经贮藏的花粉 及其生活力如何，必须经过测定，以保证杂交 效果。此外，花粉的生物学研究，作物雄性不 育和远缘杂交都要鉴定花粉育性和生活力。 花粉生活力测定的方法较多，常用的有： 形态鉴定、 染色鉴定、 花粉发芽鉴定。

3. 实验 19 花粉生活力测定 形态鉴定： 花粉有无生活力在形态上有明显差异，即形 态是否发育正常，其内部淀粉等内含物是否充实 。发育不正常的花粉，内含物不充实而空秕，形 状也不规则，大小参差不齐。而正常花粉内含物 充实饱满，形状规则，大小整齐。因内部含有较 多淀粉粒而遇 1%I-IK 溶液呈深紫色反应，遇水易 吸涨而破裂。一般适用于不育系及远缘杂交后代 花粉形态和育性的鉴定。 花粉有无生活力在形态上有明显差异，即形 态是否发育正常，其内部淀粉等内含物是否充实 。发育不正常的花粉，内含物不充实而空秕，形 状也不规则，大小参差不齐。而正常花粉内含物 充实饱满，形状规则，大小整齐。因内部含有较 多淀粉粒而遇 1%I-IK 溶液呈深紫色反应，遇水易 吸涨而破裂。一般适用于不育系及远缘杂交后代 花粉形态和育性的鉴定。

4. 实验 19 花粉生活力测定 染色鉴定： 用不同的化学试剂如氯化三苯基四氮唑 （ 2 ， 3 ， 5-triphenyl tetrazolium chloride 、 C 12 H 15 N 4 Cl ，简称 TTC 或四唑）、联苯胺茶酚等 快速鉴定花粉生活力。 花粉发芽鉴定： 配制一定浓度的蔗糖溶液等作培 养基，在人工控制条件下进行花粉发芽试验，根 据花粉发芽率的高低衡量花粉生活力。也可以在 授粉数小时后直接观察柱头花粉萌发伸长情况。 花粉发芽鉴定： 配制一定浓度的蔗糖溶液等作培 养基，在人工控制条件下进行花粉发芽试验，根 据花粉发芽率的高低衡量花粉生活力。也可以在 授粉数小时后直接观察柱头花粉萌发伸长情况。

5. 实验 19 花粉生活力测定 （一）用品 当天采集的稻、麦或棉任何一种作物的新鲜花 粉。冰箱、荧光显微镜、普通显微镜、恒湿箱、 载玻片、盖玻片、培养皿、滴管、镊子、解剖针 、吸水纸、滤纸、标签、铅笔等。 Na 2 HPO 4 、 KH 2 PO 4 、 K 3 PO 4 、 NaOH 、 MnSO 4 、 Ca （ NO 3 ） 2 、 H 3 BO 3 、 1%I-IK 溶液、乳酸、苯酚、甘油 、棉蓝、苯胺蓝、冰醋酸、蔗糖、琼脂、马铃薯 淀粉、蒸馏水。 当天采集的稻、麦或棉任何一种作物的新鲜花 粉。冰箱、荧光显微镜、普通显微镜、恒湿箱、 载玻片、盖玻片、培养皿、滴管、镊子、解剖针 、吸水纸、滤纸、标签、铅笔等。 Na 2 HPO 4 、 KH 2 PO 4 、 K 3 PO 4 、 NaOH 、 MnSO 4 、 Ca （ NO 3 ） 2 、 H 3 BO 3 、 1%I-IK 溶液、乳酸、苯酚、甘油 、棉蓝、苯胺蓝、冰醋酸、蔗糖、琼脂、马铃薯 淀粉、蒸馏水。 三、所需用品和操作方法

6. 实验 19 花粉生活力测定

7. （二）操作方法 花粉的育性和生活力可由浅入深按以下顺序 观察鉴定：外形观察 →I—IK 测定内含物的充实 度 → 染色法鉴定花粉酶学性质 → 花粉发芽试验 → 观察花粉在柱头上萌发和伸长情况。 花粉的育性和生活力可由浅入深按以下顺序 观察鉴定：外形观察 →I—IK 测定内含物的充实 度 → 染色法鉴定花粉酶学性质 → 花粉发芽试验 → 观察花粉在柱头上萌发和伸长情况。 三、所需用品和操作方法

8. 实验 19 花粉生活力测定 1 、形态鉴定 （ 1 ）在载玻片上置少量正常的稻、麦或棉的新鲜花粉，于 低倍显微镜下观察花粉形态。不同育性和生活力的花粉 在形态上有明显差异。水稻和小麦不育花粉空秕畸形， 可育花粉饱满球形；棉花不育花粉呈半圆形和棒状，大 小也参差不齐，可育花粉均为圆形，大小整齐一致。 （ 2 ）与形态观察相同，但在有花粉的载玻片上滴 1 滴 1%I— IK ，再观察花粉是否染色和染色深浅情况，以判断花粉 内含物的充实度。正常花粉应有较多的淀粉粒，遇 I—IK 呈紫黑色，不正常的染色浅或不染色。

9. 实验 19 花粉生活力测定 2 、染色鉴定 （ 1 ）试剂配制： Sorensen 磷酸缓冲液 、 0.2%TTC 溶液 （ 2 ） TTC 染色：取已成熟尚水开花的水稻、小麦或棉花 花粉 5—10 个，切断花药两端，放入小烧杯中，加 0.2%TTC 溶液，使花药完全浸入反应液中，在 30 ℃ 左右温度下染色 30—60 分钟。 （ 3 ）压片镜检：取出花药，置于载玻片上，用解剖针压 出花粉，去掉花药药壁组织，盖上盖玻片，镜检观察 ，取 5 个视野，统计着色花粉百分率。凡花粉粒变红 有生活力，染色越深生活力越强。

10. 实验 19 花粉生活力测定 3 、花粉发芽鉴定 （ 1 ）配制培养基 水稻 称取马铃署淀粉 6g 、蔗糖 20g 、 H 3 BO 3 0.01g ， 加 100ml 加蒸馏水, 煮沸呈糊状，然后置温箱内保 温保湿备用。 小麦 称取蔗糖 10g 、琼脂 3.5g 、 H 3 BO 3 0.02g, 加蒸馏 水 100ml, 加热融化后置温箱内保温保湿备用。 棉花 称取蔗糖 25g 、 MnSO 4 0.07g 、 Ca(NO 3 ) 2 0.04g 、 H 3 BO 3 0.04g, 加蒸馏水 100ml, 加热融化后置温箱内 保温保湿备用。以上培养基 pH5.2 — 6.0 。

11. 实验 19 花粉生活力测定 3 、花粉发芽鉴定 （ 2 ）置床发芽 将配制好的培养基，乘未凝结时均匀地在载 玻片上涂一薄层，制成发芽床。置室温（ 27— 29 ℃）下 5 分钟后，用毛笔蘸取刚开花的花粉，轻 轻地将花粉弹落在床上，密度要稀而均匀，使花 粉发芽力保持正常均一，也便于观察统计。

12. 实验 19 花粉生活力测定 3 、花粉发芽鉴定 （ 3 ）镜检观察 花粉置发芽床后，把载玻片放入铺有湿润滤 纸的培养皿中，加盖，水稻在 27—29 ℃下保温保 湿 5 分钟，小麦于 22—26 ℃下 1—2 小时，棉花于 30—32 ℃下培养 2—3 小时，然后镜检观察，凡花 粉管伸长超过花粉粒直径的即为发芽的花粉，统 计花粉发芽率。 花粉置发芽床后，把载玻片放入铺有湿润滤 纸的培养皿中，加盖，水稻在 27—29 ℃下保温保 湿 5 分钟，小麦于 22—26 ℃下 1—2 小时，棉花于 30—32 ℃下培养 2—3 小时，然后镜检观察，凡花 粉管伸长超过花粉粒直径的即为发芽的花粉，统 计花粉发芽率。

13. 实验 19 花粉生活力测定 4 、观察花粉在柱头上的萌发 （ 1 ）棉蓝染色法 水稻、小麦 取授粉后一定时间（水稻授粉后 10—30 分钟 、小麦授粉后 2—4 小时）的整个雌蕊，放在载玻片上 ，滴几滴棉蓝溶液（按乳酸：苯酚：甘油：蒸馏水： 棉蓝为 25 ： 25 ： 25 ： 25 ： 0 。 8 配制），盖上盖玻片， 在盖玻片上一侧滴入 40% 甘油，在另一侧用滤纸将染 料吸去，如此重复进行，直至盖玻片下部为甘油所浸 透，然后置显微镜下观察，花粉管为蓝色，而柱头组 织无色或淡蓝色。注意染色时间不宜过长。

14. 实验 19 花粉生活力测定 4 、观察花粉在柱头上的萌发 （ 1 ）棉蓝染色法 棉花 授粉后 4—6 小时，用刀片切取整个花柱，置于 70 ℃水浴中 10—15 分钟，取出，纵剖成两半，室 温下用 0.1% 棉蓝溶液染色 3—4 小时，用乳酚透明 过夜，并用新鲜乳酚封固，次日压片观察花粉管 伸长情况。

15. 实验 19 花粉生活力测定 4 、观察花粉在柱头上的萌发 （ 2 ）荧光显微镜观察 固定 取水稻开花授粉后 10—15 分钟、小麦 2—4 小时 的整个雌蕊，棉花授粉后 4—6 小时的整个花柱， 用卡诺固定液固定， 2 小时后移入 70% 酒精中保 存备用。

16. 实验 19 花粉生活力测定 4 、观察花粉在柱头上的萌发 （ 2 ）荧光显微镜观察 软化 制片前，水稻、小麦的材料用 8N NaOH 软化 10 分钟（煮沸）。棉花的用 10N NaOH 软化 10 小 时，然后水洗去碱。 镜检 将染色的材料置于载玻片上，盖上盖玻片，压 片后置荧光显微镜下观察。以 BG12 为激发光源 （蓝紫光）和 0515 为激光滤片。在此光源下，花 粉粒呈暗红色，花粉管呈淡黄色荧光，组织背景 黑色。

17. 实验 19 花粉生活力测定 四、 作业 1 、不同的方法测定花粉生活力，并对测定结果作出分析。 2 、察荧光显微制片，比较不同作物花粉管伸长情况。