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Analysis of Vitamines 第十章 维生素类 药物的分析 药物分析教研室.

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1 Analysis of Vitamines 第十章 维生素类 药物的分析 药物分析教研室

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3 Contents A B1 Vitamins C D E

4 第一节 VitA 9 1 2 3 4 5 6 7 8 Retinol (Vit A alcohol) VA acetate
VA polmitate 2-Cis Neovitamin Aa 4-Cis Neovitamin Ab 2,4-dicis Neovitamin Ac 6-Cis Isovitamin Aa

5 第一节 VitA 一、主要性质 二、鉴别试验 溶解性 不稳定性 紫外吸收 与三氯化锑呈色 1.三氯化锑反应(Carr-Price反应)
SbCl3 CHCl3(无水无醇) 蓝色 紫红色

6 第一节 VitA 2.UV Vit A3 3.TLC Vit A

7 第一节 VitA 三、含量测定 1g pure VA acetate ≈ 2.907×106I.U.
Vit A 含量表示——效价(I.U./g) International Unit Vit A acetate——效价(I.U./g) ×106 1g pure VA acetate ≈ 2.907×106I.U. VA alcohol—— 3.33×106

8 第一节 VitA 测定原理 A nm 杂质的吸收在310~ 340 nm波长范围内呈一条直线,且随波长的增大吸收度减小;
物质对光的吸收具有加和性。 A Vit A sample pure VA acetate impurities nm

9 第一节 VitA VitA醋酸酯 nm A 设: 已知 λ2 λ1 λ3 第一法——等波长法
Vit A sample pure VA acetate impurities 设: A1 A3 A2 Aλ1 已知 Aλ1=A1-X1=A1-(mλ1+C) Aλ2 Aλ3 Aλ2=A2-X2=A2-(mλ2+C) Aλ3=A3-X3=A3-(mλ3+C) Y=mX+C X2 X1 X3 λ2 λ1 λ3 A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340) 316 328 340

10 第一节 VitA VitA醇 A λ2 λ1 λ3 nm 第二法——等吸收比法 Aλ2=Aλ3=6/7Aλ1 A325(校正)
D E F L M VitA醇 310 325 334

11 测定方法 一、基本步骤 第一步:选择A (A328 或A328(校正后)) 第二步:求 第三步:求效价

12 测定方法 1IU=0.344μg Vit A 醋酸酯 1gVit A 醋酸酯=106 μg/0.344 (μg/IU)
Vit A 醋酸酯换算因子 =2.907×106 IU/1530 =1900

13 测定方法 第四步:求标示量

14 测定方法 二、第一法——纯度高的VitA acetate λmax应为328nm。 计算 ,选择A 合成 Vit A 天然鱼肝油 ① ②
计算 ,选择A

15 测定方法 A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340) ◊ ◊ ◊
A. 若【(Aλ/A328nm)-规定值】≤ (±0.02) —— A328不校正 B. 若【(Aλ/A328nm)-规定值】 有超过 (±0.02)者 A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340) A328不校正 A=A328校正 第二法

16 测定方法 三、第二法——VitA alcohol 酯 乙醚提取VA醇,洗涤,过滤 异丙醇溶解残渣
皂化法 6/7法 ① 样品前处理 酯 乙醚提取VA醇,洗涤,过滤 异丙醇溶解残渣 在 300,310,325,334nm处分别测Ai λmax应为325nm。 若λmax不在323~327nm之间,则供试品中杂质含量过高,改为色谱法将未皂化部分纯化后进行测定。 计算 ,选择A

17 测定方法 A325(校正)=6.815A325-2.555A310-4.260A334 ◊ ◊ 色谱法
B. 若(A300/A325)> 0.73 色谱法

18 测定方法 应用示例一 VitAD胶丸中VitA的含量测定
精密称取本品(规格10,000VitAIU/丸)装量差异项下(平均装量 g/丸)的内容物 g 至50ml量瓶中,用环己烷稀释至刻度,摇匀;精密量取2.0ml,置另一50 ml量瓶中,用环己烷稀释至刻度,摇匀。以环己烷为空白,测定最大吸收波长为328nm,并在下列波长处测得吸收度如下,计算Vit A的标示量百分含量。

19 测定方法 A=A328校正

20 测定方法

21 测定方法 应用示例二 称取Vit A滴剂0.1082g(标示量50 000I.U./g),加环已烷至50.0ml,取出5.0ml置于另一50 ml量瓶中,加环已烷至刻度,摇匀后置石英比色皿中,以环已烷为空白,分别于以下波长处测得相应的吸收度值,试求此滴剂中Vit A的标示量百分率:

22 测定方法 A=A328校正

23 测定方法

24 第一节 VitA 缺点 呈色不稳定 (5 ~ 10s内) 水分干扰 与标准曲线温差≤1℃ 专属性差 三氯化锑有腐蚀性
(二)三氯化锑比色法 λmax 618nm~620nm 缺点 呈色不稳定 (5 ~ 10s内) 水分干扰 与标准曲线温差≤1℃ 专属性差 三氯化锑有腐蚀性

25 第一节 VitA 色谱条件 (三)HPLC RF-HPLC同时测定人血清中Vit A和Vit E含量 Vit A Vit E 色谱柱:C18
流动相:甲醇-水 流速:1.2ml/min 检测波长与AUFS: 0~8min(330nm,0.25AUFS); 8min后(292nm,0.05AUFS) 内标:Vit A 酯 Vit A Vit E

26 第二节 VitB 氨基嘧啶环-CH2-噻唑环(季铵碱) 与生物碱沉淀剂反应 溶解性 氯化物特性 硫色素反应 紫外吸收
Vit B1(Thiamine Hydrochloride) 氨基嘧啶环-CH2-噻唑环(季铵碱) 溶解性 硫色素反应 紫外吸收 与生物碱沉淀剂反应 氯化物特性

27 第二节 VitB 一、Identification 1.硫色素荧光反应——为维生素B1所特有 NaOH -H2O

28 第二节 VitB 环合 [O] -2H 硫色素 Thiochtome 溶于丁醇,显蓝色荧光

29 第二节 VitB 2.硝酸铅反应——S元素反应 3.生物碱沉淀剂发生沉淀反应 4.氯化物反应
取本品约5mg,加NaOH T.S. 2.5ml溶解后,加铁氰化钾 T.S. 0.5ml与正丁醇5ml,强力振摇2min,放置使分层,上层显强烈的蓝色荧光;加酸使呈酸性,荧光即消失;再加碱使呈碱性,荧光又重现。 2.硝酸铅反应——S元素反应 3.生物碱沉淀剂发生沉淀反应 4.氯化物反应

30 第二节 VitB 二、Assay 非水溶液滴定法 (Non-aqueous Titrimetry) 紫外分光光度法 (UV)
硫色素荧光法 (Thiochrone Fluoremetry)

31 第二节 VitB 1. Non-aqueous Titrimetry 喹那啶红-亚甲蓝 (紫红→天蓝)

32 第二节 VitB 2. UV 1——0.1M HCl 2——H20 3——H3PO4 buffer 4——alcohol 246 232
255

33 第二节 VitB S d A b 3. Thiochrone Fluoremetry + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 对照液
λex-365nm λem-435nm VitB1 铁氰化钾 NaOH 硫色素 异丁醇 荧光 S d A b + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇 对照液 + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇 供试液

34 第三节 VitC 6 1 2 3 4 5 内酯结构 共轭 酸性强 酸性弱 烯二醇结构

35 第三节 VitC 一、主要性质 溶解性 酸性 旋光性 还原性 L-抗坏血酸 L-去氢抗坏血酸 L-二酮古罗糖酸 (有生物活性) 无生物活性

36 第三节 VitC 水解性 糖类性质 50℃ UV

37 第三节 VitC 二、鉴别 1.与AgNO3反应 2.与2,6-二氯靛酚反应 酸式色 碱式色 氧化型 还原型 3.与氧化剂反应

38 第三节 VitC 4.与糖类反应 H2O -CO2 戊糖 -3H2O 糠醛 50℃ 蓝色

39 第三节 VitC 三、含量测定(强还原性) 1.碘量法
取本品约0.2g,精密称定,加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解,加淀粉指示液1ml,立即用碘滴定液(0.05mol/L)滴定,至溶液显蓝色,在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6

40 第三节 VitC 2. 2,6-二氯靛酚滴定法 3.HPLC 人血浆中Vit C浓度的HPLC法测定

41 第三节 VitC 标准溶液制备:取V C对照品约25mg,精密称定,置25ml量瓶中,加10%偏磷酸稀释至刻度,得维生素C储备液浓度为1mg/ml,置冰箱中2℃保存,3日内可用。 血浆样品预处理:取受试者静脉血,立即置肝素化的离心试管中,3000rpm离心5min;取血浆0.5ml,加入0.5ml 10%偏磷酸溶液,涡旋混合0.5min,离心,分取上清液,置冰箱2℃贮存,直至测定。 稳定性考察:V C在血浆中不稳定,在5%偏磷酸溶液中也难以保持长期稳定,应尽可能缩短药物分离和处理时间。 样品测定:每天抽取的血样应当日测定,每天建立一条标准曲线,并随行测定高、中、低浓度的双样本质控样品。

42 第四节 Vit D 胆甾醇 7-脱氢胆甾醇 维生素 D3 麦角甾醇 维生素 D2

43 第四节 Vit D 维生素D 维生素D3 溶解性 不稳定性 旋光性 显色反应 紫外吸收

44 第四节 Vit D 二、鉴别 三、杂质检查 四、含量测定 1、麦角醇的检查 90%乙醇溶解后,加洋地黄皂苷溶液,放置18h,不得发生浑浊。
1、麦角醇的检查       90%乙醇溶解后,加洋地黄皂苷溶液,放置18h,不得发生浑浊。 2、前维生素D的光照产物     λ=280nm~320nm 四、含量测定 Ch.P 2005——NP-HPLC

45 第四节 Vit D 固定相:硅胶 流动相:正己烷-正戊醇(997:3) 检测波长:254nm 第一法:用于无维生素A醇及其他干扰的供试品
第二法:(1)皂化提取 ;(2)净化用色谱柱系统分离收集维生素D,得供试品溶液B;(3)按第一法进行测定。 第三法:当样品经皂化提取及净化用色谱系统分离收集后,前维生素D峰仍受干扰时,采用此法。

46 第五节 Vit E ﹡ Vit E (dl-α-Tocopheryl Acetate) 苯并二氢吡喃醇 Synthetic Natural

47 第五节 Vit E 苯并二氢吡喃环 + 饱和烃链 溶解性 水解性 氧化性 紫外吸收 二、鉴别 生育酚 (橙红色) 生育红 △ HNO3
1.硝酸反应

48 第五节 Vit E [O] 生育酚 对-生育醌 0.01%无水乙醇中,λmax = 284nm,λmin = 254nm 2.三氯化铁反应
3.UV 0.01%无水乙醇中,λmax = 284nm,λmin = 254nm

49 第五节 Vit E VitE Rf = 0.7 4.三氯化铁反应 薄层板 硅胶G 展开剂 环己烷 -乙醚(4 :1)
展开剂 环己烷 -乙醚(4 :1) 显色剂 硫酸(105℃ 5′) VitE Rf = 0.7

50 第五节 Vit E 三、杂质检查 1.酸度 2.生育酚 取Vit E 0.1g,加无水乙醇5ml溶解后,加二苯胺T.S.1滴,用硫酸鈰滴定液(0.01mol/L)滴定,消耗硫酸鈰滴定液(0.01mol/L)不得过1.0ml

51 第五节 Vit E 四、含量测定 24.40´内标 1.GC——Ch.P 14.54´VE 载气→N2 固定液→硅酮(OV-17)
担体→硅藻土或高分子多孔小球 柱温→265℃ 检测器→氢火焰离子化检测器(FID) 内标→正三十二烷 n ≥ 500 R≥2 USP 内标 十六酸十六醇酯 R≥1.0

52 第五节 Vit E 内标液 取正三十二烷加正己烷溶解并稀释成1.0mg/ml溶液
对照液 精密称取VitE对照品0.2011g置棕色具塞锥形瓶中,精密加入内标液10ml,密塞,振摇使溶解,取 1~3μl注入GC仪,测定,计算校正因子 供试液 精密称取供试品0.1998g置棕色具塞锥形瓶中,精密加入内标液10ml,密塞,振摇使溶解,取1~3μl注入GC仪,测定,计算含量。 已知:对照液测得A对=297456,A内=797469; 供试液测得A样=296513,A内=805741; 本品含C31H52O3应为96.0 ~ 102.0%

53 第五节 Vit E

54 第五节 Vit E 2.HPLC——JP 样品→ dl-α-生育酚 固定相→十八烷基硅烷键合硅胶 流动相→甲醇-水(49 :1)
流动相→甲醇-水(49 :1) 检测波长→292nm R>2.6 RSD≤0.8% 3.FLD——同步荧光扫描法

55 第六节 复方制剂中维生素的分析 一、离子对HPLC测定维生素 离子对试剂 水溶性 脂溶性 抗氧剂 色谱柱→ODS
流动相→A: MeOH:H2O=(200:800)[含1.1615g樟脑磺酸] B: MeOH 检测波长→脂溶性:280nm;水溶性:272nm 内标→苯酚 水溶性维生素供试液配制 取维生素片粉,精密称定,置棕色量瓶中,加DMPS 100μl,内标液5ml,流动相A溶解稀释至刻度,摇匀,过滤,备用。 取维生素片粉,精密称定,置棕色量瓶中,加DMPS 100μl,甲醇溶解稀释至刻度,摇匀,过滤,备用 离子对试剂 水溶性 脂溶性 抗氧剂

56 第六节 复方制剂中维生素的分析 二、RP-HPLC测定水溶性维生素 色谱柱→ODS
流动相→A: buffer(0.05M KH2PO4,0.2% 三乙胺,pH6.0):ACN =(97:3) B: MeOH 梯度洗脱程序→(0min)A:B(90:10)→ (20min)A:B(60:40) → (30min)A:B(90:10) 流速→1.0ml/min 检测波长→210nm 柱温→室温

57 第六节 复方制剂中维生素的分析 三、非水RP-HPLC测定脂溶性维生素 色谱柱→ODS
流动相→ACN:MeOH=(80:20) 流速→1.0ml/min 检测波长→265nm

58 Thank You !


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