1. Induction of CRMP-2 by GDNF and analysis of the CRMP-2 promoter region Yoshinori Kodama, Yoshiki Murakumo, Masatoshi Ichihara, Kumi Kawai,Yohei Shimono, and Masahide Takahashia Received 21 April 2004 Available online 7 June 2004 生科四甲 報告者：蘇士桀 指導老師：潘淑芬 老師

2. Introduction CRMP-2 ( Collapsin response mediator protein-2) 在神經系統生長過程中，會大量表現。 CRMP-2 過度表現會誘導神經軸突 (axon) 的組成和形成。 Dominant negative mutation of CRMP-2

3. Introduction RET gene was identified from activated oncogene. RET encode a receptor tyrosine kinase. Mutation of RET cause human diseases. Ex : Papillary thyroid carcinoma －乳突性甲狀腺癌 Hirschsprung’s disease －先天性巨結腸症 RET is activated by GFLs ( GDNF family ligands ) ex : GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), GFLs requires GFRαs ( GDNF family receptor αligands ). As ligand binding components.

4. binding

5. activation Ras signaling pathway AKT pathway ERK pathway

6. Introduction From other studies, revealed that… 1) GDNF/RET signaling pathway play a important role in development of the kidney and enteric nervous system. 2) CRMP-2 expression increased after nerve injury and accelerated axon regeneration in rat motor neurons Study direction 1) GDNF can enhance CRMP-2 expression in neuronal cells ? 2) Mechanism of GDNF induced CRMP-2 ? 3) Analysis CRMP-2 promoter gene.

7. Materials and methods Cell culture － TGW human neuroblastoma cells Western blotting Inhibitors and antibodies － PD98059, Ly294002, Wortmannin, PP2, PP3 Construction of luciferase reporter plasmid Transfection and luciferase assay Immunostaining － Anti-CRMP-antibody, normal rabbit immunoglobulin.

8. Result 經 GDNF 作用刺激 48 小時， CRMP-2 的表現量比剛開始未作 用時，增加了近五倍的量。 5.02 1

9. PD98059 － MEK inhibitor Wortmannin － PI3K inhibitor LY294002 － PI3K inhibitor PP2 － Src family kinase inhibitor 加入 PD98059 ，可明顯看出， 能抑制 GDNF 去誘導 CRMP-2 的 表現，但是用其他三個處理， 就只有一點點的效果而已。 證實： ERK pathway 對於 GDNF 決定 CRMP-2 的表現，可能會有影響

10. ＊ CRMP-2 promoter region ： 約在 CRMP-2 轉錄起始點的上游 1kb fragement 處 ＊ Transcription factor binding site ： Sp1, E2F, Oct-1, GATA-1/2 都可在此 region 上找到。 Analysis of CRMP-2 promoter region

11. 更加證實： ERK pathway 對於 GDNF 決定 CRMP-2 的表現，有很重要的影響。 PD98059 － ERK inhibitor

12. 在 transcription start point 上游約 -214~-48 bp 的 region ， 對於 CRMP-2 transcription 是重要的。

14. 有用 GDNF 處理過且含有 mutated binding site 時，其活性與原始的比，減少約 35 ％。 沒有用 GDNF 處理但含有 mutated binding site 時，其活性減少約 22~30 ％。 這些結果意味著， 這些 transcription factors 可能和 CRMP-2 transcription 的調控 有關聯

15. 顯示出，未用 GDNF 處理，免疫染色的結果是呈現較為 擴散且不集中的，可能表示 CRMP-2 表現量沒有很多。

16. 顯示出，用 GDNF 處理後，軸突有伸長的跡象。也表示了， GDNF 會誘導軸突的伸長。且軸突生長的過程中， CRMP-2 會在開始表現並累積。

17. 由圖 (E) 知， PP2 會大量的抑制 GDNF 誘導軸突自然生長的現象

19. 軸突的生長通常是和 Src family kinase 有關，而 不是和 ERK 的活化有關

20. Conclusion CRMP-2 在神經系統的生長過程中會表現。 CRMP-2 的表現是經由 GDNF/RET signaling pathway 的活化和 ERK 的活化所誘導。 經由 GDNF 的刺激作用後， CRMP-2 的表現提高。 會誘導 axon 的形成。 CRMP-2 transcriptional start point 上游 214~48 bp 的區域，對於 CRMP-2 transcription 是很重要的。 E2F, Sp1, Oct-1, GATA-1/2, p300 等 transcription factors 應該有 涉及 CRMP-2 transcription 的調控。 軸突的生長通常是和 Src family kinase 有關，而不是和 ERK 的活 化有關 若僅僅只是增加 CRMP-2 的表現，並不能增進軸突的自然生長。