1. Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生：林宗正、林俊宇 報告日期： 2003.12.29

2. 前言 固氮根瘤菌包括共生、協生及非共生固氮 根瘤菌， 可以將空氣中的氮素固定為氨， 轉變成作物可以利用的氮化合物，此作用 是直接增加土壤的氮素來源，可用作微生 物肥料，並能替代或減少化學氮肥的施用。 目前農業使用化學肥料過度，造成土壤中 有益微生物欠缺， 無有效固氮之根瘤菌， 氮素養分失調，單位面積產量下降

3. 微生物肥料是指含有某種活微生物或酵素 的固體或液體製劑，施用在種子、幼苗或 土壤上， 可加強營養之有效性或增加土壤 中營養份，補充土壤中有益微生物數量， 使土壤維持在良好生態環境下發揮功能

4. 目的 從植物根部分離出 Azospirillum spp. ，並鑑定其特性

5. 實驗架構 以 Nfb medium 進行培養 以 BMS medium 進行培養 觀察菌落型態 進行生化測試

6. 材料方法

7. 1. 在大度路邊取玉米、水稻、落花生三種 植物根部。 玉米 水稻 花生

8. 2.Nfb 培養基的配製 Nfb medium(g/liter): L-malic acid, 5.0 ； K 2 HPO 4, 0.5 MgSO 4 ·7H 2 O, 0.2 ； NaCl, 0.1 CaCl 2, 0.02 Trace element solution(NA 2 MoO 4 ·2H 2 O, 0.2g ; MnSO 4 ·H 2 O, 0.235g ; H 3 BO 3, 0.28g ;CuSO 4 ·5H 2 O, 0.008g ; ZnSO 4 ·7H 2 O, 0.024g ; distilled water, 1000ml)2.0ml bromthymol blue(0.5% aqueous solution(dissolve in 0.2N KOH)) 2.0ml Fe EDTA(1.64% solution) 4.0ml Vitamin solution(biotin, 0.01g; pyridoxine, 0.02g; distilled water, 1000ml) 1.0ml KOH 4.0 PH adjusted to 6.8 with KOH 1.75g agar/liter 圖四. 已配製好的 Nfb 培養基

9. 3.BMS 培養基之配製 新鮮 potato 去皮, 200g 煮 沸 30min in 1 liter, 取濾液 L-malic acid, 2.5g KOH, 2.0g Raw cane sugar, 2.5g Vitamin solution (biotin,0.01g; pyridoxin,0.02g; distilled water,1000ml ),1.0ml Bromthymol blue(0.5% alcoholic solution), 2 drops Agar 15.0g 圖五. 已配製好的 BMS 培養基

10. 3. 把根部切成數公厘的小段，放入 Nfb 培養基 表面，在 30 ℃下培養 3 天 玉米 花生 水稻

11. 4. 在 Nfb 表面下 1~2mm 處，有一層白色物狀 產生 5. 以微量吸管吸起，進行 10 倍連續稀釋，取 10 -4 、 10 -5 、 10 -6 ，塗抹在 BMS 培養基上，在 30 ℃下培養 1 至 2 週，觀察表面是否有粉紅色 菌落形成 6. 把有粉紅色菌落分離出來, 接在 NB medium 上 ，做四區劃線，純菌保存

12. 7. 在 NB medium 上取單一粉紅色菌落, 接置 SIM medium 上, 進行移動性測試 8. 在 NB medium 上取單一粉紅色菌落, 做革蘭 氏染色及鏡檢 9. 生化測試

13. 結果 在 Nfb medium 上培養三天後，培養基上有 些變化 ( 綠 → 藍 ) ，可明顯發現在培養基表面 底下 1~2mm 處有一層白色薄膜產生，根據 Bergy’s manual ，可以推測此部分菌株為 Azospirillum spp. 因為此屬菌為微好氧性， 生長在試管中靠近表面部分。 如圖九所示

14. 圖九. 水稻、 玉米、 落花生根部在 Nfb medium 上經過培養 三天之後的顏色變化及白色薄膜產生

15. 在 BMS medium 上培養，培養初期的菌落型態。平 板上出現為白色及黃色菌落，如下圖所示 玉米 水稻花生

16. 約至一星期，水稻 BMS medium 上出現粉紅色菌 落， 把此菌落再分離，接到 BMS medium 上四區劃線， 再培養一星期，如圖十三所示 圖十三. 水稻上粉紅色菌落在 BMS medium 上培養一星期後 再分離的四區劃線培養基菌落型態

17. 革蘭氏染色結果為陰性菌，在視野下為菌 紅色，外型為微彎曲，桿狀 在 SIM medium 上，可以看見輻射狀的擴散， 證明此屬菌有移動性，因此我們可以推測 此屬菌是有鞭毛的 在 oxidase, urease 兩項生化測試中，測得 oxidase 為正反應， urease 也為正反應

18. 結論 根據 Bergy’s manual 所給我們的訊息，可以 得知此屬菌的特性是生長在微好氧的環境 中，由實驗結果我們可以發現，在用 Nfb medium 培養時，此屬菌只會在表層出現一 層白色薄膜，因此我們可以得知此屬菌是 微好氧的。

19. 由文獻得知，在 BMS medium 上， Azospirillum spp. 會有粉紅色菌落產生， 我們在實驗當中也有看到這種現象，因此 把它給純化出來做進一步分析。 根據文獻上得知， Azospirillum spp. 有移動 性，代表有鞭毛。因此實驗當中利用 SIM medium 來測此屬菌是否有移動性，結果顯 示有，證明了此屬菌是有鞭毛的。

20. 根據文獻可以得知，此菌為革蘭氏陰性菌、桿狀、 螺旋菌屬。利用革蘭氏染色以及鏡檢後，我們觀 察到此菌確實為陰性菌，桿狀，菌體有些微的彎 曲。 經過生化測試之後，得知此屬菌有 oxidase 、 urease 兩種酵素。 Azospirillum spp. 在 malate 、 succinate 的有機酸 培養基裡，生長良好，因此這實驗我們選用 Nfb medium 以及 BMS medium 兩種培養基。

21. 綜合以上幾點，以及跟表一當中其他屬菌 做比較，可以得知 Azospirillum spp. 有著自 己很獨特的特性是其他屬菌所沒有的，因 此，我們更可以確定，此實驗所分離出來 的這屬菌確實是 Azospirillum spp.

22. Table1.Differerental characteristics of the genus Azospirillum and other morphologically or physiologically similar gegera( 出自 Bergy’s manual)

23. 參考文獻 Tarrand, krieg and Dobereiner (1979).Genus Azospirillum. Bergy’s manual,section2.aerobic/microaerophlic,motile,helical/vibrioid gram- negative bacteria 94-103 (1995) Dung, N., Kraut, M., Klingmüller, W.: Isolation and characterization of Azospirillum strains from soil and rice plants in North Vietnam NATO ASI Series, Azospirillum VI and related Microorganisms. I. Fendrik et al. (eds) Springer-Verlag Berlin, Heidelberg G 37, 559-566 Mori E, Fani R, Fulchieri M, Gallori E and Bazzicalupo M (1995). Involvment of Lon Protease in iron uptake in Azospirillum. NATO ASI Series, Vol. G37. Azospirillum VI and Related Microorganisms.Genetics-Physiology-Ecology. IFendrik, M Del Gallo, J Vanderleyden and M de Zamaroczy Eds. Springer::137-141 Bazzicalupo M, Fani R, Fantappiè O, Gallori E, Mori E and Polsinelli M (1990). Isolation and characterization of Azospirillum brasilense mutants altered in the production of siderophores. In: Nitrogen fixation. Polsinelli M, Materassi R, Vincenzini M eds, Kluver Academic:291-292