3.3 Kiekybinių požymių lokusų (QTL) identifikavimas

3.3 Kiekybinių požymių lokusų (QTL) identifikavimas
3.3.1 Įvadas. 3.3.2 QTL nustatymo populiacijos sukūrimas ir fenotipiniai požymiai. 3.3.3 QTL paieškos molekulinių žymenų sistemos. 3.3.4 QTL nustatymo statistiniai metodai. 3.3.5 QTL testavimas. 3.3.6 Miško medžių QTL tyrimų apibendrinimas. 3.3.7 Kandidatinių genų paieška. 3.3.8 QTL naudojimas selekcijoje.

3.3.1 Įvadas Kiekybinių požymių lokusai (ang. quantitative trait loci (QTL))- tai vietos chromosomose, kuriose yra genai, sąlygojantys kiekybinius požymius. QTL vietas žymi molekuliniai žymenys. Molekuliniai žymenys tai nedidelės DNR molekulės, kurių nukleotidų sekos atitinka nukleotidų sekas, esančias geno sudėtyje ar netoli ir paveldimos vienoje sukibimo grupėje. Individų atranka, panaudojant informaciją apie genetinius žymenų sąsajas su genais, vadinama atranka žymenų pagalba (angl. MAS: marker asssisted selection) eikėtų atrasti tokią DNR atkarpą, kurios iglis būtų pakankamai didlesi, kad sąsaja su genu būtų patikima (ne atsiktitnė) ir makankamia mažas, ka dbūtų glaima efetyviai identifikuoti ir pasigamnti. The idea behind marker assisted selection is that there may be genes with significant effects that may be targeted specifically in selection. Some traits are controlled by single genes (e.g. hair colour) but most traits of economic importance are quantitative traits that most likely are controlled by a fairly large number of genes. However, some of these genes might have a larger effect. Such genes can be called major genes located at QTL. Although the term QTL strictly applies to genes of any effect, in practice it refers only to major genes, as only these will be large enough to be detected and mapped on the genome. Following the pattern of inheritance at such QTL might assist in selection. Kiekybinių genų vietos chromosomose vadinamos lokusais (location ang. Vieta) (kiekybinių požymių lokusai QTL)

Molekulinio žymens samprata
Molekuliniai žymenys nustatomi specialiais DNR sukarpymo, specifinių sekų pagausimo, iRNR klonavimo metodais, kurių rezultatas specifiniai DNR fragmentai elektroforezės gelyje Laboratorinių DNR tyrimų rezultatas: elektroforezės gelis Lauko bandymas A B C C B DNR pavydžiai A eikėtų atrasti tokią DNR atkarpą, kurios iglis būtų pakankamai didlesi, kad sąsaja su genu būtų patikima (ne atsiktitnė) ir makankamia mažas, ka dbūtų glaima efetyviai identifikuoti ir pasigamnti. The idea behind marker assisted selection is that there may be genes with significant effects that may be targeted specifically in selection. Some traits are controlled by single genes (e.g. hair colour) but most traits of economic importance are quantitative traits that most likely are controlled by a fairly large number of genes. However, some of these genes might have a larger effect. Such genes can be called major genes located at QTL. Although the term QTL strictly applies to genes of any effect, in practice it refers only to major genes, as only these will be large enough to be detected and mapped on the genome. Following the pattern of inheritance at such QTL might assist in selection. Kiekybinių genų vietos chromosomose vadinamos lokusais (location ang. Vieta) (kiekybinių požymių lokusai QTL) Genų sąlygojančių požymį buvimas nustatomas pagal fenotipinio požymio buvimą (pvz. ankstyva augimo pradžia) Su požymiais galimai susijęs žymuo nustatomas pagal specifinius DNR fragmentus elektroforezės gelyje

QTL samprata Dauguma ekonomiškai svarbių požymių yra sąlygojami daugelio genų (poligenų). Šie genai vadinami kiekybiniais, nes kiekvieno geno įtaką galima išreikšti skaitine verte (kiekybe). Kiekybinių genų vietos chromosomose vadinamos lokusais (kiekybinių požymių lokusai- QTL). Tarp jų yra genai turintys didesnę įtaką požymiui (pagrindiniai genai). Galima surasti molekulinius žymenis susėjusius su pagrindiniais genais ir naudoti kaip pagalbinę priemonė atrenkant individus (atranka žymenų pagalba (MAS)). Anksčiau, klasikinė selekcija buvo paremta atrankos, rekombinacijos ir išbandymo metodais. Išbandymo metu, įvertinus individualaus medžio ir jam giminingų medžių augimą, bandoma prognozuoti jo genetinė vertė. Tam riekia daug laiko ir kaštų. Klasikinis kiekybinių požymių tyrimų modelis buvo paremtas prielaidomis, kad požymius kontroliuoja daug tos pačios svarbos genų, kurie paveldimi nepriklausomai vienas nuo kito. Atradus molekulinius žymenis – trumpas DNR molekules, kurių sekos atitinka dalies geno ar su juo susijusio geno nukleotidų sekas- būtų įmanoma ženkliai padidinti selekcijos efektyvumą. Be to, daugumas miško medžių ūkinių požymių yra sąlygojami kelių genų grupių, kurių tarpe yra didesnės ir mažesnės svarbos genų ir šios genų grupės gali būti paveldimos priklausomai viena nuo kitos. Genus sudaro dešimtys tūkstančių nukleotidų sekų, kurias sunku identifikuoti dėl didelės kiekybės. Efektyviau rasti tam tikrą santykinai neilgą DNR atkarpą, kuriuos sekos parodytų geno buvimą. Tokias trumpas DNR molekules būtų galima lengvai pasigaminti ir identifikuoti. Žymenų teikiama informacija būtų ypač vertinga identifikuojant požymius, kurių įvertimui riekia, kad medis būtų pasiekęs tam tikrą amžių ar lytinę brandą (pvz. medienos kietumas, žydėjimo gausumas, lytinė asimetrija) ar kai požymio vertinimas yra brangus ar destruktyvus (reikalaujantis medžių pjovimo). 20% 50% 15% 5% Žymuo QTL2 QTL1 QTL3 Kiekybinį požymį sąlygojantys stipresnės įtakos genai, kurių vietos chromosomose vadinamos kiekybinio požymio lokusais (ang. trumpinys- QTL).

QTL paieškos prielaidos
20% Jeigu visi požymį įtakuojantys genai turėtų vienodą įtaką, būtu sunku juos visus atskirai identifikuoti ir naudoti selekcijoje. Kai kurie genai turi didesnę įtaką ar įtakuoja kitų genų veiklą (vadinami kiekybinio požymio lokusais). Tikslas rasti žymenis susijusias su šiais genais, galutinis tikslas- rasti pačius genus. QTL požymis sąlygojamas keliolikos genų= žymens svarba priklausys nuo susijusio geno įtakos Priklausomai nuo QTL, žymenys gali turėti skirtingą įtaką požymio kintamumui ŽymuoM 50% QTL1 Požymis kontroliuojami eilės genų, kurių įtaka išreikšta procentais (pavyzdžiui kuo didesnis procentas tuo daugiau medienos) QTL2 15% ŽymuoN 5% 5% 5%

Žymenų ir QTL sąsajos nustatymo komponentai
Polimorfinė populiacija ir požymis (daug skirtingų tikslinio geno formų) ir bent vienas iš tėvų heterozigotinis. Tinkama žymenų sistema tikslinio požymio QTL paieškai. Kryžminimai (ar bus žymenys atskirti nuo genų per rekombinaciją?). Palikuonys = QTL nustatymo populiacija (požymių (QTL buvimo) ir žymenų sąsajos įvertimas). Žymens ir QTL sąsajos įvertinimo statistiniai metodai M G m g Polimorfinė populiacija Kryžminimas Palikuonys Molekulinių žymenų ir genų sąsajos nustatomos atliekant specialius bandymus, kur tam tikrus požymius ir hipotetines sąsajas su molekuliniais žymenimis turintys tėvai yra kryžminami, siekiant nustatyti rekombinacijos įtaką molekulinio žymens ir geno sąsajai. Lytinų ląstelių formavimosi metu vyksta rekombinacija- porinės chromosomos pasikeičia segmentais. Rekombinacijos metu neatskirti chromosomos segmentai juose esantys kartu paveldimi genai vadinam sukibomo grupėmis. Tai tuos pačius ar glaudžiai susėjusius požymius kontroliuojančios genų grupės, kurių atskyrimas reikštų ženklų defektą gyvybingai organizmo funkcijai. Tyrimais siekiama nustatyti ar rekombinacija nutraukę sąsaja tarp hipotetinio žymens ir tikslinio geno. Kuo toliau tam tikras žymuo randasi nuo tikslinio geno DNR grandinėje chromosomoje, tuo didesnė tikimybė kad žymuo ir genas paklius į skirtingas sukibomo grupes rekombinacijos metu ir tuo silpnesnis yra ryšys tarp žymens ir geno. Daug alternatyvių geno formų Statistiniai metodai: požymio ir žymens sąsajai nustatyti

Žymenų ir QTL sąsajos nustatymo principas (1)
QTL nustatomi įvertinant sąsajas tarp molekulinių žymenų ir tikslinių požymių prieš ir po rekombinacijos (tėvai kryžminimai  palikuonys). Tikrinama ar rekombinacija atskyrė fenotipinį požymį ir molekulinį žymenį Hipotezė: netiesioginis žymuo M susijęs su teigiamu genu (G), žymuo m susijęs su neigiamu genu (g) Principas: kuo silpniau žymuo susiejąs su genu, tuo toliau yra jų lokusai chromosomoje, tuo dažniau juos atskiria rekombinacija Lytinės ląstelės žiedadulkėse Rekombinacija: lytinų ląstelių formavimo metu iš tėvo ir motinos gautos porinės chromosomos pasikečia dalimis. Galimi 4 genotipai: M-G; M-g; m-G; m-g Molekulinių žymenų ir genų sąsajos nustatomos atliekant specialius bandymus, kur tam tikrus požymius ir hipotetines sąsajas su molekuliniais žymenimis turintys tėvai yra kryžminami, siekiant nustatyti rekombinacijos įtaką molekulinio žymens ir geno sąsajai. Lytinų ląstelių formavimosi metu vyksta rekombinacija- porinės chromosomos pasikeičia segmentais. Rekombinacijos metu neatskirti chromosomos segmentai juose esantys kartu paveldimi genai vadinam sukibomo grupėmis. Tai tuos pačius ar glaudžiai susėjusius požymius kontroliuojančios genų grupės, kurių atskyrimas reikštų ženklų defektą gyvybingai organizmo funkcijai. Tyrimais siekiama nustatyti ar rekombinacija nutraukę sąsaja tarp hipotetinio žymens ir tikslinio geno. Kuo toliau tam tikras žymuo randasi nuo tikslinio geno DNR grandinėje chromosomoje, tuo didesnė tikimybė kad žymuo ir genas paklius į skirtingas sukibomo grupes rekombinacijos metu ir tuo silpnesnis yra ryšys tarp žymens ir geno. Porinės chromosomos M G m g Žymuo 3 rekombinantiniai genotipai (38 %) (QTL ir žymuo nesusieją nes buvo atskirti) 5 nerekombinantiniai genotipai (QTL ir žymuo vienoje sukibimo grupėje) M m Genas G g Pakankamo dydžio ir polimorfizmo tėvinė populiacija Kryžminimas Įvertinimas, statistiniai metodai

Žymenų ir genų sąsajos nustatymo principas (2)
Hipotezė: netiesioginis žymuo M susijęs su teigiamu genu (G), žymuo m susijęs su neigiamu genu (g) M G m g Žymuo Genas Tėvai Palikuonys Rekombinacija 85 % 15 % Kryžminimas Tėvas Motina Anksti ir vėlai sezoninį augimą pradedantys p. eglės genotipai Baltijos regiono eglės populiacijų bandyme Atlikti kryžminimai: teigiamą požymį (geną G) ir jo žymenį M) turintis individas (vėlyva sezoninio augimo pradžia ir tiesus) kryžminamas su šio geno neturinčiu individu (ankstyva augimo pradžia ir kreivas, daugiastiebis). Palikuonyse nustatyta, kurie iš jų turėjo žymenį (M ar m) ir geną G ir g (pagal požymio išraišką fenotipe). Rekombinacijos dažnis tik 15%. Žymens M patikimumas- 85 % Kaip įvertinti netiesioginio žymens ir QTL geno sąsajas po rekombinacijos? Paveiksle pavaizduotas dviejų alelių (G ir g) ir su jais susijusių žymenų (M ir m) paveldėjimas palikuonyse. Genai G ir g turi įtakos ekonomiškai svarbiam požymiui. Genas G turi teigiamą įtaką. Mes negalime identifikuoti palikuonių genotipą, turintį žymenis M-m. Tėvinis genotipas yra heterozigotinis (turi skirtingus alelius- G ir g). Jeigu žymuo M yra patikimai susijęs su genu G, yra didelė tikimybė, kad palikuonys paveldėję žymenį M, taip pat paveldės ir geną G. Po rekombinacijos galimi 4 genotipai. Paveiksle pateiktame pavyzdyje 85 proc. genotipų pavedėjusių G alelį taip pat pavedėjo M žymens sekas atitinkantį DNR fragmentą t.y. žymuo M buvo neskirtas rekombinacijos ir paveldėtas vienoje sukibimo grupėje su genu G. Tačiau, po rekombinacijos tėvinio genotipo lytinėse ląstelėse, 15 proc. palikuonių genotipų turinčių M žymenį nepaveldėjo G geno ar atvirkščiai turintys G geną nepaveldėjo M žymens. Todėl netiesioginių žymenų ir genų sąsajas pravartu išreikšti paveldėjimo tikimybe, ar tikybe būti vienoje sukibimo grupėje rekombinacijos metu. Atrenkant individus, reikėtų vadovautis ir kitais fenotipiniai požymiais (kitų poligenų įtaka), o molekuliniai žymenys teiktų svarią papildomą informaciją, kurios svoris priklausytų nuo žymens ir geno paveldėjimo vienoje sukibimo grupėje tikimybės.

3.3.2 QTL nustatymo populiacijos sukūrimas ir fenotipiniai požymiai
Populiacijos sukūrimo principas Pavyzdžiui, ankstyvą augimą sąlygojančius genus bus galima identifikuoti pagal pumpurų sprogimo laiką 1. Tėvų parinkimas: turintys norimus genus, kurie identifikuojami pagal fenotipinio požymio išraišką; požymis turi būti paveldimas) Molekulinių žymenų sistema, galinti identifikuoti DNR fragmentus susijusius su tikslinais genais 2. Kryžmindamas= testas ar rekombinacija nutrauks žymens ir geno sąsają? 3. Palikuonys = QTL nustatymo populiacija: palikuonių įvertinimas tikslu nustatyti kiek palikuonių turėjo ir fenotipinį požymį ir molekulinį žymenį = sąsajos stiprumas (nuo medelių) Kiekviename etape medžiaga ir metodai parenkami taip kad maksimaliai palengvintų tikslo įgyvendinimą

Rekombinacija tarp porinių chromosomų lytinėje ląstelėje
Tėvinės poros Tėvinių porų parinkimo problema: kaip parinkti heterozigotines poras (bent vieną iš tėvų)? Nuo to priklauso QTL nustatymui reikalingos populiacijos sukūrimo metodai Heterozigotinis individas turi skirtingas požymį sąlygojančio geno formas, vadinamas aleliais (polimorfinis genas) Po rekombinacijos Rekombinacija tarp porinių chromosomų lytinėje ląstelėje Homozigotos atveju sunku nustatyti ar rekombinaciją tarp žymens (M) ir geno (G), nes M ir G vienodi abejose chromosomose (įvykus rekombinacijai tarp M ir G vienoje chromosomoje, žymuo M ar genas G patektų iš kitos chromosomos) G M Homozigotinis Žymuo Nors žymuo M ir genas G buvo skirtingose sukibimo grupėse (nesusiję), jie bus aptikti kartu palikuonyse G M g m G M Heterozigotinis m M Žymuo M ir genas G nesusiję: išreikštas genas G neturės žymens M G g

QTL populiacijos sukūrimas (1)
Klasikinis modelis: tikslas sukurti heterozigotas 2-oje kartoje (prielaida: M1 susijęs su Q1 (aukštas), o M2 su Q2 (žemas) 1 karta Bus reikalingi kodominantiniai žymenys nes reikės atskirti heterozigotinius palikuonis Parenkami kontrastingų požymių tėvai Žymuo Galimas ir atgalinis kryžminimas su vienu iš tėvų (tik vienas iš tėvų bus heterozingotinis, todėl bus galima nustatyti tik vieno iš alelių sąsają su QTL, todėl dominantiniai žymenys būtų pakankami Aukščio QTL Aukštas Žema 2 karta Tarpinis Savidulka Parenkami tarpinio aukščio tėvai, kurie yra heterozigotiniai Ar aukšti ? Bandoma ar genotipai atitinka fenotipus: pvz. ar palikuonys tik su M1 žymeniu tikrai aukščiausi. 3 karta Ar tarpiniai ? Ar žemi ? Jei neįvyko rekombinacija tarp M ir Q, galimos 3 genotipų kombinacijos Genotipas 1 Genotipas 2 Genotipas 3 3 karta= “QTL paieškos populiacija”: lyginamos tokios sąsajos M1-Q1, M2-Q2, pvz. ar yra skirtumai tarp M1M1 ir M1M2 genotipų vidutinio aukščio? PROBLEMA su miško medžiais: savidulka ar giminių kryžminimai = mažai gyvybingi palikuonys

Trijų kartų modelis: tikslas sukurti heterozigotas 2-oje kartoje. Minusas – reikia 3-jų kartų (nemažos laiko sąnaudos) . Išeitis panaudoti selekcines populiacijas su jau atliktais kryžminimais. 1 karta Tėvas: aukštas Motina: žema Tėvas: aukštas Motina: žema M4 Q4 M1 Q1 M2 Q2 M3 Q3 Žymuo Parenkami kontrastingų požymių tėvai Q1 Q2 Aukščio QTL 2 karta Motina: tarpinė Tėvas: tarpinis M2 M1 Q2 Q1 M4 M3 Q4 Q3 Parenkami tarpinio aukščio tėvai, kurie yra heterozigotiniai Ar Aukšti ? Ar Tarpiniai ? Ar Tarpiniai ? Ar Žemi ? 3 karta M3 M1 Q3 Q1 Bandoma ar genotipai atitinka fenotipus M4 M1 Q4 Q1 M3 M2 Q3 Q2 M4 M2 Q4 Q2 Jei neįvyko rekombinacija tarp M ir Q, galimos 4 genotipų kombinacijos Genotipas 1 Genotipas 2 Genotipas 3 Genotipas 4 3 karta= QTL populiacija: lyginamos tokios sąsajos M1-Q1, M2-Q2, M3-Q3, M4-Q4, pvz. ar yra skirtumai tarp M1M3 ir M1M4 genotipų vidutinio aukščio?

Dviejų kartų modelis (1): tikslas parinkti genetiškai tolimas tėvines poras, tikintis, kad bent viena jų bus heterozigotinė (aukštos medžių genetinės įvairovės panaudojimas; galimi rūšių hibridai). Problema – galimybė, kad tėvai homozigotiniai; sprendimas – kontroliniai kelių kandidatinių tėvinių porų palikuonių heterozigotiškumo tyrimai. Kontroliniai heterozigotiškumo tyrimai Motina: tarpinė Tėvas: tarpinis 1 karta M4 M3 Q4 Q3 M2 M1 Q2 Q1 Parenkami ženkliai skirtingos kilmės tarpinio aukščio tėvai, tikėtina- heterozigotiniai aukštas- aukštas- -žemas -žemas 2 karta Fenotipai: aukšti+ tarpiniai =aukštesni Tarpiniai + Žemi=žemesni Jei neįvyko rekombinacija, galimos 4 genotipų kombinacijos, tačiau žymenys identifikuos tik M1 ir M3 genotipus: bus lyginami tik 2-jų grupių fenotipai = nukentės tikslumas M3 M1 Q3 Q1 M4 Q4 Genotipas 1 Genotipas 2 M3 M2 Q3 Q2 M4 M2 Q4 Q2 Lyginami Genotipas 3 Genotipas 4 2 karta= QTL populiacija: tinka dominantiniams žymenims; lyginamos tokios sąsajos pvz. M1 su Q1 (tėvas) ir pvz. M3 su Q3 (motina).

Dviejų kartų modelis (2 pusiau sibai): tikslas parinkti potencialiai heterozigotinį motinmedį ir naudoti laisvo apsidulkinimo sėklas. Vienodai tinka dominantiniams ir kodominantiniams žymenims. Problema – galimybė, kad tėvai homozigotiniai; sprendimas – kontroliniai kelių kandidatinių tėvinių porų palikuonių heterozigotiškumo tyrimai. Kontroliniai heterozigotiškumo tyrimai Motina: tarpinė Tėvas: žiedadulkių mišinys 1 karta M4 M3 Q4 Q3 x X Parenkami heterozigotiniai motinmedžiai (tėvas laisvo apdulkinimo) Aukštesni Žemesni 2 karta M3 x Q3 X M4 x Q4 X Jei neįvyko rekombinacija, galimos 2 genotipų kombinacijos; žymenys identifikuos tik M1 ir M3 genotipus: bus lyginami tik 2-jų grupių fenotipai Genotipas 1 Genotipas 2 2 karta= QTL populiacija: lyginamos tokios sąsajos pvz. M3 su Q3 ir pvz. M4 su Q4.

Tiksliniai fenotipiniai požymiai (1)
QTL nustatymo efektyvumas didžia dalimi priklauso nuo fenotipinio požymio. Kriterijai: Genų sąlygotumo kompleksiškumas (vienos ir kelių grupės susijusių genų) ir QTL nustatymo lengvumas. Ekonominė vertė (QTL nustatymas duotų taikomąją naudą). QTL analizės tikslas – nustatyti kiek genų kontroliuoja požymį ir koks jų santykinis efektas (įtaka požymiui). Tinkamiausias požymis: sąlygojamas nedidelio genų skaičiaus; genų įtaka- nuo vidutinės iki stiprios; stipriai paveldimas (ribota aplinkos sąlygų įtaka)

Tiksliniai fenotipiniai požymiai (2)
Tikslinės miško medžių fenotipinių požymių grupės: Adaptaciniai požymiai (pvz. fenologija: ramybės būsena, sezoninio augimo pradžia ir pabaiga, ūglių medėjimas). Reprodukciniai požymiai (pvz. lytinė brada ir asimetrija, žydėjimo gausumas, vegetatyvinis dauginimas). Medienos kokybė (pvz. bazinis tankis, cheminės savybės, mikrofibrilių kampas). Atsparumas kenkėjams (galima panaudoti gausią ž.ū. kultūrų patirtį). Tokie požymiai kaip medžių aukštis ar produktyvumas yra kompleksiniai (keliolikos požymių grupių sąveikos išraiška), todėl efektyviau pradžioje nustatyti šių pirminių požymių QTL.

Miško medžių QTL medžiaga (1)
Tam, kad gauti heterozigotinius individus QTL tyrimams galima naudoti: Skritingų populiacijų palikuonis. Du tolimos kilmės ir skirtingų adaptacinių požymių genotipų adaptacinių požymių lokusai bus polimorfiniai (skirtingi tam tikro geno aleliai), o dauguma jų palikuonių – heterozigotiniai. Rūšių hibridai. Du artimų rūšių individai yra genetiškai skirtingi daugumoje lokusų, todėl jų palikuonys bus heterozigotiniai. Tikslinga naudoti stipriai tam tikroje rūšyje išreikštų požymių QTL identifikacijai (pvz. “pendula” genas Picea abies porūšyje ar Pinus contorta atsparumas šalčiui). P. sylvestris populiacijų bandymas Lietuvoje. Stulpeliai parodo populiacijų kilmės vietas Egzotinių pušų bandymas- P. sylvestris dešinėje, Pinus contorta kairėje

Populiacijų bandymai. Tai želdiniai skirti populiacijų genetinės įvairovės, požymių genetinio kintamumo, paveldėjimo laipsnio ir perkėlimo naudos tyrimui. Populiacijų atstovai tolygiai išdėstyti bandymo plote (sumišrinti), kad specifinių dirvos sąlygų įtaka jų augimui būtų kuo mažesnė. Bandymo įveisimas: medeliai išdėstomi eilėse pagal spec. mišrinimo schemą 4 raudoni tam tikros grupės individai auga beveik visose dirvos sąlygose, todėl jų grupės vidutinės požymiu reikšmės nebus stipriai iškraipytas dirvos sąlygų skirtumų. printed Pinus sylvestris tolimų populiacijų bandymas (kilmės vietos pažymėtu stulpeliais, kurie parodo šių populiacijų produktyvumą- aukščiau brūkšnio pranašesni už vietines. P. eglės populiacijų bandymas

Eglės populiacijų perkėlimo bandymas Lietuvoje. Populiacijų kilmės vietos pažymėtos taškais. Rezultatai: genotipai ženkliai skyrėsi savo adaptaciniais požymiais, priklausomai nuo kilmės vietos temperatūros ir fotoperiodo. Adaptacinių požymių QTL paieškoje, kryžminti šiaurinį ir pietinį genotipus. Palikuonyse dominuotų heterozigotiniai lokusai AB ab AB ab QTL paieškos tyrimai Š P Š-šiaurinis, P- pietinis genotipai Taškai žymi kilmės vietas. Didesni taškai= ankstesnė sezoninio augimo pradžia ir pabaiga, mažesnis aukštis, daugiau dvistiebių medelių. Šiaurinių ir pietinių genotipų adaptaciniai požymiai esminiai skiriasi.

3.3.3 QTL paieškos molekulinių žymenų sistemos
Žymenų sistemos tikslas QTL tyrimuose yra identifikuoti tikslinių požymių genus jų paveldėjimo iš tėvų į palikuonis metu. Žymenų sistemos skiriasi genų žymėjimo efektyvumu ir kaštais, kas turi esminę įtaką QTL nustatymo metodikai. Specifinis DNR fragmentas elektroforezės gelyje būdingas tik tam tikrą požymį turintiems medžiams M m G g Polimorfinė populiacija (Žymuo susijęs su požymiu) Palikuonys Žymuo susijęs su požymiu Kryžminimas (rekombinacija)

Žymenų tipai (2) Dominantiniai žymenys negali atskirti vieno geno alternatyvių formų (alelių). Gali tik identifikuoti ar genas (vienas iš alelių) yra, pvz. RAPD Kodominantiniai žymenys- gali identifikuoti alternatyvias vieno geno formas (alelius) Žymuo N gali identifikuoti abu ankstyvos Q1 ir vėlyvos augimo pradžios alelį Q2. Todėl gali atskirti heterozigotinius genotipus= tikslesni, bet sudėtingesni. Žymuo M gali identifikuoti ankstyvos augimo pradžios alelį Q1 (bet ne jo alternatyvią formą- vėlyvos augimo pradžios alelį Q2) 1 2 3 1 2 3 Q1Q1= homozigotinis ankstyvas Q1Q2= heterozigotinis tarpinis Q2Q2= homozigotinis vėlyvas Q1Q1= homozigotinis ankstyvas Q1Q2= heterozigotinis tarpinis Q2Q2= homozigotinis vėlyvas N M Q1 ir Q2 aleliai porinėse chromosomose gali skirtis tik keliais nukleotidais Žymuo žymuo RFLP analizės rezultatai: DNR fragmentai gelyje RAPD analizės rezultatai: DNR fragmentai gelyje

Žymenų tipai (3) Dominantiniai žymenys tinka vieno motinmedžio genų identifikacijai jo palikuonių (pusiau sibų) šeimoje. Kodominantinių žymenų reikia abiejų tėvų genų identifikacijai jų palikuonių (pilnų sibų) šeimoje Tėvas: aukštas Motina: tarpinė M1 Q1 M2 Q2 Palikuonis: tarpinis Tėvas: aukštas Motina: žema M1 Q1 M2 Q2 Palikuonis: tarpinis Ar M2 susijęs su Q2? Tereikia identifikuoti Q2 QTL. Tik motinmedis turi M2 ir Q2. Ar M1 susijęs su Q1 ir ar M2 susijęs su Q2? Žymenų sistema turi sugebėti atskirti Q1 ir Q2

Mikrosatelitai ir QTL SSR gali būti naudojami QTL paieškoje: SSR yra kodominantiniai ir gali efektyviai identifikuoti didelį skaičių tam tikro geno alternatyvių formų (alelių) populiacijoje pagal kartotinių sekų pakartojimų skaičiaus polimorfizmą (daug įvairaus ilgio kartotinių sekų fragmentų = daug alelinių variantų). Esant aukštam alelių identifikacijos tikslumui ir tikslinių genų formų įvairovei (polimorfizmui) populiacijoje, yra santykinai didesnė galimybe rasti sąsajas tarp šių fragmentų ilgio ir palikuonių tikslinių požymių QTL. CACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGT CACACACACACACACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT QTL CACACACA GTGTGTGT

QTL paieškos efektyvumas
QTL paieškos efektyvumas didžia dalimi priklauso nuo bandomos medžiagos ir taikomos žymenų sistemos Medžiaga: genetinė įvairovė (skirtingi genai) = dauguma požymį sąlygojančių alternatyvių genų formų (alelių) yra skirtingi (polimorfiniai) ir stipriai paveldimi. Heterozigotinis genotipas (dauguma genų turi polimorfinius alelius) Porinės chromosomos DNR Tėvinė Motininė Žymenų sistema: turėtų remtis žiniomis apie tikslinių genų sekas (DNR tyrimai reikalauja nemažų kaštų) Polimorfiniai aleliai (dvi skirtingos vieno geno formos) Atsitiktinės žymenų sistemos bando atsitiktiniu būdu aptikti gana mažą DNR sekų fragmentą tarp milijono kitų sekų Pagrindinio ar su juo susijusių genų dalies sekų žinojimas ženkliai padidintų žymenų paieškos efektyvumą Monomorfiniai aleliai (dvi vienodos vieno geno formos) 5 genai sąlygojantys vieną požymį (didesni turi svaresnę įtaką)

Miško medžių QTL: žymenys
Naudojant atsitiktines žymenų sistemas, tikimybė aptikti QTL žymenis nedidelė (neefektyvu), Išeitis- paruošti žymenis pagal tam tikrose sąlygose išreikštų polimorfinių genų dalių kopijas (EST žymenys). Principas: vieno genotipo kopijos auginamos skirtinguose, tam tikro geno išraišką skatinančiose sąlygose; izoliuojama iRNR→cDNR-AFLP skirtingų cDNR identifikacijai, žymenų kūrimas iš polimorfinių cDNR dalių) sausra laistymas Išreikšti genai šaltis šiluma Išreikšti genai pakenktas sveikas Išreikšti genai klonai klonai klonai

Neutralūs ir išreikšti žymenys
Kadangi didžioji dalis genomo sudaryta iš nekoduojamos DNR(~95%), dauguma tradicinių žymenų sistemų žymi nekoduojamas sekas, kurios nepriklausomos nuo atrankos (žymenys neutralūs atrankai) Žymenų sistemos pasirinkimas priklauso nuo tyrimo tikslo: Neutralūs žymenys tinkamiausi siekiant įvertinti genetinę įvairovę ar atrankai neutralių požymių QTL. Ieškant adaptacinių požymių QTL, išreikštus genus identifikuojantys žymenys yra pranašesni (atsitiktinė paieška neefektyvi). Išreikšti žymenys: EST, cDNR-AFLP; neutralūs pvz.: RFLP, RAPD, AFLP Sekvenuoto Populus genomo dydis- 500 milijonų bp, Eucalyptus mln bp, pušies milijonų bp (vidutinis genų skaičius ) Genominė DNR (visų chromosomų DNR laisvoje formoje): dalys kur yra aktyvūs genai sudaro tik ~15 proc (storos atkarpos paveiksle). Sekvenuoto Populus genomo dydis- 500 mln. bp, Eucalyptus mln bp, Pinus mln. bp

Specialių žymenų kūrimas (1)
Genų ekspresijos bandymas: vieno genotipo kopijos skirtingose sąlygose. iRNR izoliacija ir kopijavimas į cDNR (klonavimas plazmidėse), AFLP analizė: polimorfinių cDNR identifikacija, Polimorfinių cDNR bangų izoliavimas gelyje ir sekvenavimas, (a) Žymenų pažyminčių tikslinius ar susijusius genus kūrimas, (b) cDNR atitikmenų paieška DNR mikrosekų metodu, genų bibliotekose siekiant nusakyti kandidatinius genus. Žymenų testavimas ir naudojimas QTL paieškoje (pagrinde SNP ir EST žymenys). cDNA-AFLP: cDNA-amplified fragment length polymorphism analysis cDNA-AFLP is an improvement of traditional differential display techniques. It is a PCR-based method which starts with cDNA synthesis from total or mRNA using random hexamers as primers. The obtained fragments are digested with two restriction enzymes, normally a 4-cutter and a 6-cutter, and adapters are ligated to the ends of the fragments. In the first amplification step only those fragments are amplified that were digested by both restriction enzymes and thus have different adapters at the end. In the following amplification steps, the complex starting mixture of cDNA is fractionated into smaller subsets by selective PCR amplification using primers on the adapters that contain one or more extra nucleotides. By increasing the stringency of the PCR amplification (adding more additional nucleotides to the primers), the sensitivity of the analysis can be increased. In this way, also genes with a low expression level can be detected. The fragments that are amplified are roughly bp. These fragments are separated on high-resolution gels. The differences in the intensity of the bands that can be observed provide a good measure of the relative differences in the levels of gene expression. Further characterisation of interesting transcripts often requires the identification of the corresponding full-length cDNA. cDNA-AFLP can generate a global overview of gene expression, but it involves a great amount of PCR reactions. In addition, separately obtained data sets cannot readily be compared, which is in contrast to SAGE and microarrays data. However, using cDNA-AFLP, accurate gene expression profiles can be determined by quantitative analysis of band intensities. Furthermore, the sensitivity and specificity of the method allows the detection of poorly expressed genes and the determination of subtle differences in transcriptional activity. For more information about cDNA-AFLP read Breyne, Dreesen et al. (2003). “Qauntitative cDNA-AFLP analysis for genome-wide expression studies.” Molecular Genetics and Genomics 269:

“cDNR+AFLP=EST” metodas: tikslas identifikuoti tam tikrose aplinkose išreikštus genus ir iš jų pagaminti žymenis, taikomus įvairiose žymenų sistemose. 1. Tam tikroje aplinkoje auginamų genotipų iRNR izoliavimas iš audinių, kuriuose tiksliniai genai yra išreikšti (pvz. pumpuras, jei tiriami pumpurų ramybės būsenos genai). 2. Komplimentarios DNR (cDNR) sintetinimas pagal iRNR kopijas ir cDNR sukarpymas dviejų skirtingų restriktazių pagalba (viena dažnai, kita retai kerpanti). 3. DNR fragmentų galų jungimosi neutralizavimas prijungiant adapterius (pagal restriktazių sekas) 4a. PCR 1 ciklas: naudojami 2 pradmenys (sekos= restriktazių atpažįstamos sekos + 1 nukleotidas). Atrenkami pradų sekoms tinkantys fragmentai. 4b. PCR 2 ciklas: 2 nauji pradmenys (sekos = restriktazės sekos ar > naujų nukleotidų). Rezultate atrenkami tam tikri fragmentai 5. Elektroforezės gelyje bus matomi po 2-jų atrankos ciklų patekę DNR fragmentai. Polimorfiniai fragmentai- tai bandomose sąlygose išreikšto geno dalys (genotipai identiški, skirtumas tik aplinkos sąlygose, kurios įtakavo skirtingų genų išraišką). Šie fragmentai izoliuojami iš gelio ir sekvenuojami tolesniam išbandymui.

6. cDNR izoliavimas ir klonavimas 7. cDNR sekvenavimas Restriktazės Rekombinuotos plazmidės cDNR fragmentų identifikacija: nukleotidų sekų nustatymas automatiniuose sekvenatoriuose cDNR cDNR Bakterijos Gelis Elektroforezės gelyje izoliuoti polimorfiniai cDNR fragmentai (išreikštų genų dalys) įterpiami į bakterijų plazmides (patogiau atlikti tolesnius sekvenavimo darbus) cDNR Žymenų kūrimas ir testavimas 9. Testavimas bandymuose. 8. Atitikmenų paieška. Sekų lyginimas duomenų bazėse DNR mikrosekų bibliotekose pagrinde EST, SNP, STS žymenys (RFLP markeriai ir PCR pradai), Prieš bandant cDNR fragmentus kaip žymenis, bandoma nustatyti jų sekų atitikmenis su jau rastais genais ar žymenismi duomenų bazėse ar DNR mikrosekų bibliotekose (hibridizacija su žinomais genais) 10. Rezultatas- kandidatiniai genai

AFLP detalės: adapterių prijungimo, PCR pradmenų gamybos ir DNR pagausino principai Restriktazė Bandoma DNR Adapteris Pradmuo 1. DNR sukarpymas 2 skirtingomis restriktazėmis, 2. Adapterių prijungimas (“lipnių” fragmentų galų neutralizavimas), 3a. Pirmas PCR ciklas: pradmuo= restriktazės atpažįstama seka + 1 naujas nukleotidas; PCR pagausinimas tik tam tikrų fragmentų, turinčių naują nukleotidą po restriktazės sekos. 3b. Antras PCR ciklas: specialių pradmenų gamyba- restriktazės seka nukleotidai; PCR amplifikacija (tam tikrų fragmentų atranka) AFLP sudaro 4 etapai: 1. DNR sukarpymas 2 skirtingomis restriktazėmis 2. Adapterių prijungimas (pagal restriktazės atpažįstamas sekas); gaunami dviejų grandinių DNR fragmentai paruošti tolesnei PCR amplifikacijai, Pirmas PCR ciklas: specialių pradų gamyba- restriktazės seka + 1 nukleotidais; PCR amplifikacija (tam tikrų fragmentų atranka), Antras PCR ciklas: specialių pradų gamyba- restriktazės seka nukleotidai; PCR amplifikacija (tam tikrų fragmentų atranka)

Bandymas klimatinėje kameroje. Tikslas: rasti žymenis susijusius su augimo pabaigos QTL. Metodai: Du to paties genotipo klonai auginami skirtingose sąlygose ir išreikštų genų identifikacija pagal cDNR-AFLP analizę. Augimo sąlygų imitacija Augimo pabaigos imitacija Pumpurų krovimo pradžios stadijoje iš pumpurų izoliuojama iRNR Šviesa, +20C Tamsa, +10 C cDNR sintetinamas ir sukarpymas restriktazėmis Adapterių prijungimas PCR 1 ciklas (pradmenys+1 nukleotidas) PCR 2 ciklas (pradmenys+2 ir > nukleotidai) Elektroforezė, polimorfinių bangų izoliavimas ir žymenų kūrimas Rezultatas: gauti skirtingi iš viršūninių meristemų izoliuotos iRNR fragmentai – galimos atsakingų genų (QTL) dalys; reikalingas tolesnis patikrinimas tyrimais

Bandymo klimatinėje kameroje pavyzdys. Tikslas įvertinti p. eglės genotipų toleranciją šalčio sausrai: vienas genotipų rinkinys laikytas 1-2 savaites su užšaldytomis šaknimis po intensyvia šviesa (pažeidimo pobūdis: intensyvi šviesa= garinamas vanduo, o užsalusios šaknys nekompensuoja vandens netekties = džiuvimas), kitas tų pačių genotipų rinkinys – optimaliose augimui sąlygose. Nuotraukoje vonios pripildytos gliukolio (-3C) intensyvioje šviesoje.

cDNR pritaikymas žymenų sistemose
EST žymenų gamyba: EST tai bp ilgio polimorfinių cDNR fragmentų dalys, žyminčios cDNR pradžią ir pabaigą (PCR pradai ar markeriai hibridizacijai DNR gardelėse ir RFLP sistemoje) EST savo ruožtu naudojami SNP (pavienių nukleotidų polimorfizmo atkarpų) žymenų paieškai DNR mikrosekose - geną identifikuojančios dalys. RFLP markeriai hibridizacijai: ilgis~100 bp (polimorfiniai cDNR fragmentai) bp (identifikuoti nedideli genai) Pradai žymintys unikalių sekų atkarpas (STS) (SSR ar ISSR pradai: specifinės DNR atkarpos, juosiančios 2-3 bp (1-10 bp) dydžio sekų pasikartojimo regionus DNR molekulėje)

Genominės duomenų bazės
Puiki išeitis žymenų sistemų analizės optimizavimui (markerių , adapterių pradų sekų paieška). Nacionalinio biotechnologijų centro duomenų bazės: cDNR ar EST sekos Augalų genomo duomenų bazė: RFLP markeriai tam tikro geno hibridizacijai (kukurūzas)

EST sukūrimas Genotipai bandomi tam tikroje aplinkoje.
Iš specifinių audinių, kuriuose vyksta atsakas į stresą, izoliuojama iRNR (geno kopijos), iš jų sintetinamos stabilesnės cDNR molekulės. Atsitiktiniu būdu atrankos cDNR dalinai sekvenuojamos ir lyginamos su cDNR bibliotekose esančiomis žinomos funkcijos cDNR sekomis Nustačius atitinkamus, pagaminami EST žymenys identifikuojantį tam tikrą geną. EST žymenys naudojami QTL testavimui ir kandidatinių genų paieškos tymuose. Sekvenavimas ir atitinkančių sekų paieška bibliotekose ACGGACUG cDNR Genotipo atsakas į stresą= išreikšti genai Nacionalinio biotechnologijų centro cDNR duomenų bazės iRNR

Žymenų sistemos: santrauka
RFLP (+) tiksli , kodominantinė, (-) reikalauja daug darbo, nemažo DNR kiekio, ir darbo su radioaktyviomis medžiagomis. RAPD (+) nedaug DNR (tinka sėklų analizėms), pigus, greitas (-) dominantinis ir mažiau tikslus; patobulinimas- AFLP (RFLP ir PCR kombinacija: tikslesnis, vis tiek dominantinis), Eilė PCR ir restriktazių panaudojimu pagrįstų naujų sistemų, kurios skiriasi tuo kaip gaunami PCR pradai ar markeriai identifikacijai (kodominantiniai, tikslūs): EST, SCAR, STS, SNP (pradų sekos iš cDNR bibliotekų ar genų ekspresijos tyrimų, iš genominės DNR bibliotekų ir polimorfinių RAPD fragmentų) Efektyvus miško medžių žymenų generavimo būdas- genų sekų duomenų bazių analizė ar genų ekspresijos tyrimai ir DNR mikrogardelių panaudojimas

3.3.4. QTL nustatymo statistiniai metodai
Statistinių metodų tikslas nustatyti potencialaus QTL žymens ir požymio ryšio esmingumą ir QTL žymens įtaką fenotipinio požymio išraiškai. Paversti DNR fragmentų buvimą gelyje į skaičius (0- nėra, 1- yra) ir suskirstyti palikuonių fenotipinių požymių vertes pagal kiekvieno fragmento buvimo ir nebuvimo klases (pagal žymenų genotipus). Kiekvienam fragmentui (potencialiam žymeniui), palyginti palikuonių fenotipinio požymio vidurkius tarp tarp žymenų genotipų (t.y. nustatyti pvz. palikuonių aukščio skirtumus tarp M1M1 ir M2M2 (kodominantinis žymuo) ar tarp turinčiu ir neturinčių M fragmento palikuonių (dominantinis žymuo): ANOVA, t-testas, regresija (kodais išreikštų žymenų genotipų sąsaja su požymio fenotipu), Chi-kvadrato testas (kategoriniai kintamieji). Jei skirtumai esminiai- žymuo susijęs su atitinkamo požymio QTL; skirtumo tarp vidurkių esmingumas = žymens sąsajos su QTL stiprumo rodiklis. Jei yra daugiau nei vienas potencialus žymuo (žymenų polimorfizmas gelyje), naudojamas intervalų interpoliacijos (maksimalios tikimybės) metodas (Maximum Likelihood-Lander & Botstein, 1989), alternatyva Composite Interval Mapping (Linked markers-Zeng, 1993).

Duomenų paruošimas DNR fragmentų (bangų) buvimas gelyje paverčiamas į 0 ir 1 duomenų masyvą pagal fragmentų dydį ir požymio išraiškos vienetą. Genotipų , turinčių tam tikro ilgio DNR fragmentą skaičius (%) kiekvienoje žievės formos klasėje 100 400 1200 2000 A B C 1 DNR fragmento dydis (bp) Palikuonys 100 400 1200 2000 A B C DNR fragmento dydis (bp) DNR fragmento dydis (bp) Palikuonys Fragmentų dydžio skalė A B C Eglės žievės forma

Žymens ir požymio ryšys (1)
Tikslas rasti žymenis, susijusius su sezoninio augimo pradžios QTL Q1Q1= homozigotinis ankstyvas Q1Q2= heterozigotinis tarpinis Q2Q2= homozigotinis vėlyvas 1 2 3 Tėvinė populiacija: polimorfizmas augimo pradžios laike, pvz., provenencijų bandymas QTL genotipų požymiai: Q1Q1= homozigotinis, ankstyva pradžia; Q1Q2 = heterozigotinis, tarpinis; Q2Q2 = homozigotinis, vėlyvas. RFLP gelis Kryžminimui parenkami tėvai: ankstyvas (Q1Q1), tarpinis (Q1Q2), atliekami jų DNR tyrimai (pvz. RFLP), kur žymuo M1~ susijęs su Q1 (ankstyvas), o M2 ~ susijęs su Q2 (vėlyvas). M M Polimorfinio žymens lokusas Kiti lokusai Q1 M1 Q2 M2 Tėvas Motina Jei M žymuo susijęs su augimo pradžios QTL, tai po rekombinacijos palikuonys tik su M1 žymeniu bus ankstyvi, o su M1M2 – tarpiniai. Žymuo QTL

Atliekami palikuonių DNR tyrimai: RFLP metodu nustatomas palikuonių RFLP genotipas (M1M1 ar M1M2); Lauko bandyme nustatomas palikuonių RFLP genotipų augimo pradžios laikas (fenotipas =QTL indikatorius) Yij= µ +Mi +ij Palikuonio Nr. 3. ANOVA pagalba lyginamas RFLP genotipų vidutinis augimo pradžios laikas: jei skirtumas esminis- M žymuo susijęs su augimo pradžios QTL; skirtumo esmingumas = sąsajos stiprumas Žymuo M 1 2 3 4 150 100 400 fragmento dydis (bp) Skirtumas esminis, p<0,05, R2=78% (…) M1M1 Augimo pradžia M1M2 Anksti Vėlai 2 1 Skirtumas neesminis R2=8% Vėlai 2 1 1200 Augimo pradžia 2000 RFLP genotipas M1M1 Anksti M1M2 M1M2 M1M1 M1M1 M1M1 M1M2 Žymens M RFLP genotipai Fenotipas lauko bandyme Žymens M RFLP genotipai Tarpinis Tarpinis Tarpinis Ankstyvas Ankstyvas Alternatyva 1: M žymuo susijęs su augimo pradžios QTL, sąsajos stiprumas R2=78% Alternatyva 2: M žymuo nesusijęs su augimo pradžios QTL (atskirti rekombinacijos)

Vertinant kelis žymenų lokusus (polimorfiniai DNR fragmentai gelyje): ANOVA žymenų sąsajai, Maksimalios tikimybės algoritmas- atrankai tarp žymenų Žymens M genotipai Skirtumas esminis R2=78% Esminis R2=41% Esminis R2=25% Esminis R2=11% 2. ANOVA modelis Yij= µ +Mi +ij M1M1 M2M2 Žymens N genotipai N1N1 N2N2 Žymens P genotipai P1P1 P2P2 Žymens R genotipai R1R1 R2R2 1. RFLP gelis Palikuonio Nr. 100 400 1200 2000 1 2 3 4 150 M (…) Žymuo RFLP genotipai M1M1 M1M2 N P R N1N1 N2N2 nėra P1P2 P1P1 R2R2 R1R2 3. Tinkamiausio žymens nustatymas pagal skirtumo dydį Maksimali QTL tikimybė tarp žymenų M ir N Skirtumo esmingumas pvz. F reikšmė Riba kai sąsajos nėra Rezultatai: sankabos grupių žemėlapyje, kur atstumai tarp žymenų (a) = rekombinacijų tarp žymenų % a1 a2 a3 P (25%) M (78%) N (41%) R (11%)

Kategoriniams kintamiesiems tinka Chi-kvadrato testas, t.y. kai fenotipinis požymis vertinamas keliomis klasėmis (pvz. žievės forma): tikrinama ar sąsaja tarp kiekvieno DNR fragmento ir žievės formos yra atsitiktinė. Neatsitiktinę sąsają parodo genotipų, turinčių tam tikrą DNR fragmentą, skaičiaus skirtumas tarp atskirų požymio klasių. Fragmento dydis 400 bp 20 40 60 80 100 A B C Žievės forma Genotipų skaičius (%) ` Fragmento dydis 1200 bp Skirtumai neesminiai (visų žievės formų genotipai turėjo vienodą skaičių genotipų su fragmentu)= sąsajos tarp fragmento ir žievės formos nėra Skirtumai esminiai (tik C žievės formos genotipai turėjo šį fragmentą) Chi-kvadrato testas naudojamas nustatyti: ar yra esminis nukrypimas nuo atsitiktinio DNR fragmentų pasiskirstymo atskirose žievės formos klasėse? A B C Eglės žievės forma Skirtumo esmingumas = QTL ir žymens sąsajos stiprumas

Dominantinio žymens atveju, atliekama ANOVA, kur įvertimas fenotipinio požymio skirtumo esmingumas tarp palikuonių su žymeniu ir be žymens. Dviejų žymenų identifikacijos atvejis (M1 = lygi, M2 = supleišėjusi žievė). Genotipas M1-M1 = fenotipas (lygi žievė) (A tipas nuotraukoje), M1-M2 = tarpinė (B) ir M2-M2= supleišėjusi (C). Skirtumai tarp žievės klasės vidurkių nustatomi ANOVA ar t-testu Žymuo M2 1 Žieves forma balais, A=1, B = 2, C = 3 3 100 M1 lygi žievė (A forma nuotraukoje) M1 ir M2 tarpinė žievė (B forma nuotraukoje) M2 supleišėjusi žievė (C forma nuotraukoje) Žymuo M1 1 Žieves forma balais, A=1, B = 2, C = 3 3 M1 400 DNR fragmento dydis (bp) M2 1200 2000 A B C A B C Jei skirtumai esminiai = potencialus QTL žymuo Skirtumų esmingumas = sąsajos su QTL stiprumas 26 medžiai 54 medžių 23 medžiai

Tam, kad gauti pakankamą individų skaičių sąsajos analizei reikalingas pakankamas šeimos palikuonių skaičiaus. Pavyzdžiui, dispersinės analizės patikimumas, lyginant 2 medžių grupių skirtumo esmingumą, priklauso nuo medžių skaičiaus grupėse; paprastai, lyginant miško medžių kiekybinius požymius, grupių skaičius turėtų būti nemažesnis nei 20 (priklauso nuo požymio dispersijos). Todėl lyginant vieno žymens genotipus, reikėtų apie 40 palikuonių (20+20) Medžių skaičius kiekvienoje žymens genotipo grupėje Tikėtina, kad dauguma QTL paieškos žymenų sistemų produktuos 3-4 polimorfinius (potencialius) QTL žymenis, todėl apytikris minimalus QTL nustatymo populiacijos dydis > 100 individų Viso 20 20 20 20 20 20 = 120 palikuonių N1N1 N2N2 P1P1 P2P2 R1R1 R2R2 Žymens N genotipai Žymens P genotipai Žymens R genotipai

Žymens įtakos nustatymas
Su žymeniu susijusio QTL įtaka požymiui nustatoma lyginant žymens genotipų fenotipinio požymio skirtumą su kitų žymenų genotipų skirtumais Pvz. M žymens genotipų (M1M1 ir M2M2) skirtumas pakeltas kvadratu / iš kitų žymenų genotipų skirtumų kvadratinės sumos. M įtaka= Gm2 / suma(Gi2) =7*7 / ((4*4)+(6*6)+(3*3)) = (49 /61)*100 = 80 % Maksimali QTL tikimybė tarp žymenų M ir N Augimo pradžios skirtumas, dienomis Riba kai sąsajos nėra a1 a2 a3 P M (80%) N R Žymenų išdėstymas sankabos grupėje (cM)

Intervalinė interpoliacija
Jei yra keli QTL žymenys, tinkamiausias nustatomas Maksimalios tikimybės1 metodu kiekvienam žymeniui paskaičiuojant LOD* rodiklį, kuris pagrinde išreiškia rekombinacijos tarp žymens ir QTL dažnį, dažnius paverčiant tikimybėmis. LOD= log (Ty sąsaja yra/ Tn kad sąsaja atsitiktinė), kur Tikimybė (Ty) =Prop(nerekomb)n * Prop(rekomb)m, kur n ir m = nerekombinantų ir rekombinantų skaičius, Prop = proporcija. Tikimybė (Tn) =0.5 n+m Maksimali QTL tikimybė netoli nuo M žymens: LOD interpoliacijos rezultatas LOD rodiklis leidžia palyginti skirtingus žymenis ir požymius LOD reikšmės Riba kai sąsajos nėra LOD<3 a1 a2 a3 P M N R 1-Lander & Botstein, 1989 Žymenų išdėstymas sankabos grupėje (cM) * LOD- logarythm of odds ratio

QTL nustatymo efektyvumo padidinimas (1)
Palikuonių klonavimas: Tipinių fenotipų atranka lauko bandymuose DNR žymenų identifikacijai Palikuonys klonuojami Tėvai Palikuonys Išbandomi Fenotipinių požymių įvertinimo tikslumo padidinimas (vietoje vieno fenotipo išbandome keliolika jo kopijų= tiksliau nustatomas fenotipinio požymio genetinis sąlygotumas) DNR tyrimams reikalingų individų skaičiaus sumažinimas = mažesni kaštai.

Atrankinis genotipavimas- tik atrinktų palikuonių genotipų DNR analizė (ang. selective genotyping). Tėvai Pasirenkami palikuonys su ekstremaliomis fenotipinio požymio reikšmėmis, siekiant padidinti QTL aptikimo tikimybę. DNR tyrimams reikalingų individų skaičiaus sumažinimas = mažesni kaštai. Palikuonys Išbandomi Ekstremalių fenotipų (pvz. aukštas ir žemas medis) atranka lauko bandymuose DNR žymenų identifikacijai

Tėvai Palikuonys Išbandomi Grupinis genotipavimas- atrinktų genotipų mišinio DNR analizė (ang. bulk segregant analysis). Siekiant padidinti QTL aptikimo tikimybę, pasirenkami palikuonys su ekstremaliomis fenotipinio požymio reikšmėmis Jų DNR apjungiama ir analizuojama atskirai. DNR tyrimams reikalingų individų skaičiaus sumažinimas = mažesni kaštai. DNR apjungiama DNR apjungiama Aukštų medžių DNR Žemų medžių DNR Ekstremalūs fenotipai atrenkami lauko bandymuose, jų DNR pavydžiai apjungiami ir naudojami žymenų ir požymio sąsajų tyrime

QTL nustatymo statistiniai metodai (sankibos grupių žemėlapiai)
Kiekybinis požymis gali būti sąlygojamas keliolikos genų, Sudaromi genus žyminčių žymenų sąsajos su jų QTL žemėlapiai (sankibos grupių žemėlapiai kiekvienai žymenų kategorijai) Tam tikrų QTL žymenys išdėstomi žemėlapiuose, kur atstumas tarp dviejų žymenų išreiškiamas pagal tai kaip dažnai jie paveldimi vienoje sukibimo grupėje Rekombinacijos tarp dviejų žymenų dažnis išreiškiamas centimorganais (cM) = rekombinantinių genotipų (žymenys buvo atskirti rekombinacijos metu) procentas. Vienoje sankibos grupėje esantys žymenys ~ atitinka vieną chromosomą 11 25 43 cM M1 Tiesus M2 žievė lygi M3 Vėlyva forma M3 Minkšta mediena Sankibos grupe Nr.1. SSR žymenų sistema Pvz, atstumas (cM) tapr žymenų M1 ir M2 rekombinantų sk. x 100 bendras medžių sk. = 33 300 = 11% arba 11 cM

Nustačius QTL: tolesni žingsniai
QTL testavimas (tikrinimas) Kandidatinių genų identifikacija ir tai alternatyvių geno/QTL formų (alelių paieška) Tam reikalingos tikslias nukleotidų sekas atpažįstančios žymenų sistemos: Gausių cDNR ir EST sekų duomenų bazių efektyvus panaudojimas Alternatyvios vieno geno formos (aleliai) galai skirtis tik keliais nukleotidais: identifikavus QTL žinoma tik viena iš šio geno formų QTL EST žymenys genų izoliavimui ir klonavimui. EST genų polimorfizmo nustatymas pavienių nukleotidų polimorfizmo (SNP) ar DNR mikro sekų metodais.

3.3.5 QTL testavimas Efektyviam QTL panaudojimui selekcijoje, reikalingas QTL patikrinimas skirtingose aplinkose, skirtingu laiku (skirtingame amžiuje) ir naudojant skirtingas genetines linijas (šeimas). Be šių testavimo tyrimų, QTL tinkami naudoti tik toje aplinkoje ir su ta šeima, su kuriais jie buvau gauti. Palikuonys Tėvai Nr. 1 Nr. 2 QTL Palikuonys Tėvai Nr. 1 Nr. 2 QTL Palikuonys Tėvai Nr. 1 Nr. 2 QTL Palikuonys Tėvai Nr. 3 Nr. 4 QTL ? ? Ar tie patys QTL (požymio ir žymenų sąsajos) bus gauti su skirtingais tėviniais genotipais? Ar tie patys QTL bus gauti išbandant tuos pačius genotipus skirtingose aplinkose kelių augimo periodų metu?

Jei testavimo bandymo metu QTL nebuvo pakartotinai gauti, priežastis gali būti per mažas QTL populiacijos dydis, todėl QTL nustatymui reikalingos didesnės palikuonių populiacijos (ypač mažos įtakos QTL nustatymui). Pageidautinas mažesnis požymių kompleksiškumas: pvz. vietoje aukščio vertinti fenologinius požymius ir fotosintetinį potencialą. Nepriklausomų tyrimų rezultatai turi būti įrašomi į bendrus tam tikrai rūšiai genolapius (palyginamieji genolapiai) Pavyzdys: Eucalyptus grandis- keli nepriklausomi tyrimai su skirtingomis šeimomis aptiko medienos bazinio tankio QTL homologinėse sankibos grupėse (Grattapagia ir kt. 1996, Verhaegen ir kt. 1997). QTL identifikacijai naudingas požymių išskaidymas siekiant prieiti kaip galima arčiau prie tiesiogiai požymį sąlygojančių genų. Pavyzdys dešinėje: genotipo aukštis priklauso nuo jo sezoninio augimo trukmės: vėlesnė augimo pabaiga=ilgesnis augimo laikas= didesnis aukštis. Todėl pravartu ieškoti sąsajų tarp žymenų ir augimo pabaigtos laiko, o ne medelių aukščio. Šalčio pakenkimų rizika Vasara Žiema Genotipas A (ankstyva AP pabaiga) Genotipas B (vėlyva AP pabaiga)

3.3.6 Miško medžių QTL identifikacijos rezultatai
Tiksliniai požymiai: Adaptaciniai požymiai (fenologija, tolerancija šalčiui, sausrai) Reprodukciniai požymiai (lytinė branda, žydėjimo gausumas, lytinė asimetrija), Atsparumas ligoms ir kenkėjams (tolerancija aliuminiui) Medienos kokybė (bazinis tankis, stiebo suktumas, gravitaciniai požymiai, cheminės savybės (celiuliozės išeiga)) Kiti požymiai (pvz. eglės “pendula” forma, lapų požymiai, stiebo tiesumas, H, D, šaknydamosi energija, dauginimosi gyvašakėmis geba)

Rūšys (eilės tvarka): Eukaliptas, Populus gentis, pietinės pušys, P
Rūšys (eilės tvarka): Eukaliptas, Populus gentis, pietinės pušys, P. eglė, p. pušis, pocūgė. Pagrinde naudotos selekcinių populiacijų rėmuose sukurtos sibų šeimos: atbuline seka nuo palikuonių link tėvų. Naudos žymenų sistemos pradedant nuo RAPD, RFLP, AFLP, SSR, dabartiniu metu: cDNA-AFLP, EST, SNP. Efektyvi tolimų populiacijų ir artimų rūšių hibridizacija. Pastaba: tokie požymiai kaip aukštis yra išvestiniai, kelių kitų kiekybinių požymių išdava, todėl efektyviau sumažinti požymį įtakojančių genų grupių skaičių (kompleksiškumą) ir ieškoti tiesioginių genų grupių QTL.

Spygliuočių miško medžių rūšyse rasti QTL (tipiniai pavydžiai)

Lapuočių miško medžių rūšyse rasti QTL (tipiniai pavydžiai)

QTL rezultatai įrašomi į genolapius
LG-1(I) LG-2(VI) LG-19(XII) LG-4(III) LG-5(II) LG-3(X) LG-6(XIII) LG-24 LG-25 LG-26 LG-27 LG-28 LG-9(XI) LG-10 LG-11(XVIII) LG-12(IV) LG-13(VIII) LG-14 LG-22 LG-15 LG-29 LG-16(XIV) LG-18 LG-30 LG-17 LG-23 LG-20(XVI) LG-7 LG-8(V) LG-21 Height Age 4 Boardman, Biomass Age 1 Wallula, Basal Callus Wallula Height Age 1 Lateral Root Growth Height Age 4 Boardman Height & Diameter Age 8 Clatskanie Diameter Age 4 Lateral Root Length Diameter Age 4 Boardman Clatskanie, Biomass Age 1 Wallula Root Biomass Root Initiation 0 cM 20 cM Populus sankibos grupių genolapis: kiekybinius požymius lemia vienu metu daug genų (QTL), išsidėsčiusių daugelyje chromosomų vietų (medžių aukščio QTL pažymėti raudonai)

MAS ir QTL tyrimų pasiskirstymas pagal medžių gentis (FAO 2004)

MAS ir QTL tyrimų pasiskirstymas pagal požymius (FAO 2004)

Reprodukciniai požymiai (naudingi selekcijai): Lytinė branda,
Žydėjimo gausumas Lytinė asimetrija (vyriškų ir moteriškų žiedų santykis) Ūglių šaknydamosi geba Picea abies moteriškas strobilas Reprodukcinių požymio pavyzdys: lytinė branda. Sėklinės kilmės paprastosios pušies genotipas pasiekęs lytinė brandą 9 metų amžiuje (paprastai pasiekiam m). Nuotraukoje matomi vyriški ir moteriški strobilai (netikri žiedai).

Adaptaciniai požymiai tai požymiai turintys esminę įtaką individų išlikimui (tuo pačiu ekonominei naudai). Šiaurėje vieni iš svarbiausių yra fenologiniai požymiai ir su jais suėjusi tolerancija šalčiui ir šalnų išvengimas, pietose- tolerancija sausrai. Fenologiniai požymiai tai medžio fiziologinių būsenų kitimo laikas metų bėgyje (augimo pradžia ir pabaiga, ramybės būsena, ūglių sumedėjimo lapsnis, ramybės būsenos praradimas) a) anksti pradėjęs sezoninį augimą šiaurinės Lietuvos p. eglės genotipas pakenktas pavasarinių šalnų b) iš šaltesnio klimato atkelti p. eglės genotipo pradeda augimą anksčiau nei vietiniai. a) b)

Medienos kokybės požymiai (naudingi selekcijai):
Medienos bazinis tankis (kietumas) Tracheidžių ilgis, mikrofibrilių kampas Celiuliozės išeiga Cheminės savybės Tracheidžių ilgis 50 100 200 400 600 Density (kg/m3) Distance (x 25µm) Medienos Bazinis tankis priklauso nuo ląstelių sienelės storio; vėlyvos medienos (formuojamos augimo sezono pabaigoje) ląstelių sienelės yra storesnės Mikrofibrilių kampas- vidutinis celiuliozės molekulių kampas ląstelės sienleje

Rezultatų apibendrinimas
Rezultatus galima sisteminti pagal tokius kriterijus: Požymį sąlygojančių QTL skaičius ir QTL įtakos stiprumas (kiek QTL sąlygoja požymį ir kokia QTL įtaka požymio išraiškai?), Įvairių požymių QTL išsidėstymas genome (chromosomose) (ar panašių požymių QTL yra netoli vienas kito?), QTL išraiškos stabilumas (ar pakartojus tyrimą su ta pačia medžiaga bus gauti tie patys QTL?).

Požymio QTL skaičius ir įtaka
Nors teoriškai kiekybiniai požymiai sąlygojami daugelio geno, rastas stebėtinai mažas tam tikro požymio QTL skaičius (vidurkis 2,7 QTL per požymį) QTL sąlygotas fenotipinio požymio kintamumo procentas vyravo nuo 4 iki 63 %= pagrinde rasta nedaug bet svarios įtakos QTL, Daugumai poligeninių požymių tokias išvadas sunku pritaikyti, Priežastis sąlyginai mažos (<150) palikuonių QTL tyrimo populiacijos (dėl aukštų DNR tyrimų kaštų) = buvo aptiktas mažesnis QTL skaičius nei iš tikrųjų bei jų įtaka fenotipiniams požymiams gauta didesnė nei iš tikrųjų Todėl, galutinės išvados dėl QTL skaičiaus ir įtakos darytinos tik po tolesnių QTL testavimo tyrimų Apibendrinimas paveiksle: tam tikrą požymį sąlygojantys QTL ir jų įtaka fenotipiniam požymiui Nustatytas tyrimais QTL skaičius Tikėtinas QTL skaičius

QTL išsidėstymas chromosomose
Principas: ta pati QTL nustatymo populiacija tiriama skirtingais žymenimis ir vertinami įvairūs fenotipiniai požymiai Rezultatai: Pagrinde, fenotipiškai susijusių požymių QTL buvo vienodose ar netolimose sankibos grupėse Jei QTL įtaka vienoda= vienas genas koduoja baltymą, kuris yra nors ir nevienodai bet reikalingas abiem požymiams, Jei QTL įtaka skirtinga: du susiję genai ar kitą bet susijusį požymi sąlygojantys genai. Jei fenotipiškai nesusijusių požymių QTL buvo susiję= pleotropija- vienas genas įtakoja kelis požymius. Pavydžiai: Eucalyptus (lapo plotas-H; medienos kietumas-stiebo suktumas-žievės masė), Castanea (ūglių plaukuotumas-stiebo spalva); Populus (įvairūs lapų požymiai)

QTL išraiškos stabilumas (1)
QTL aptikimas ir išreikštumas priklauso nuo laiko, aplinkos ir genetinių faktorių Laiko faktoriai: genai įjungiami tam tikrame medžių ontogenezės etape (pvz. lytinės branda) Aplinkos faktoriai: aplinka inicijuoja tam tikrų genų įjungimą (pvz. pumpurų ramybės būsena ar sezoninio augimo pradžia) Genetiniai faktoriai: kai kurie QTL būdingi tik tam tikrai šeimai; todėl vertingiausia QTL aptikti keliose šeimose Stiprios įtakos QTL greičiausiai yra genai įjungėjai, priimantys aplinkos signalus ir inicijuojantys kitų genų grupių veiklą (pvz. sezoniniai medžių fiziologinės būsenos pokyčiai)

QTL nebuvo pakartotinai aptikti vienoje QTL populiacijoje: Aukštis (H) ir skersmuo (D) kelių augimo periodų (AP) metu (Populus, Pinus taeda), Priežastys: vieno AP metu aptikti susijusių požymių QTL, kurie dėl kitokių aplinkos sąlygų ar fiziologinės būsenos buvo kitaip išreikšti ir turėjo kitokias sąsajas su medžių H ir D kito AP metu (= reikalinga mažiau kompleksinių požymių analizė, pvz. augimo ritmas vietoje aukščio) Buvo aptikti kelių augimo periodų metu: Lapų dėmėtligė (Populus), jaunų sėjinukų aukštis (Pinus pinaster), medienos tankis (Eucalyptus, Pinus taeda), pumpurų sprogimas (Pseudotsuga menziesi) Išvada: didesnis QTL stabilumas rastas adaptaciniams požymiams (priežastis= aukštesnis paveldimumas) ir rezistentiškumo kenkėjams požymiams (mažesnis kompleksiškumas). Patikima strategija: kandidatinių genų paieška ir jų STS ar EST žymenų gamyba ir naudojamas selekcijoje

Požymio ir QTL sąsaja gali žymėti ir su tuo požymiu susijusių kitų požymių QTL Pavyzdžiui: kadangi medžių medienos bazinis tankis (medienos kietumas) yra susijęs su jų sezoninio augimo pabaigos laiku, QTL susijęs su medienos kietumu gali būti ir genų atsakingų už augimo terminaciją dalis. Metinė rievė susideda iš ankstyvosios (minkštos) ir vėlyvosios (kietos) medienos. Augimui į aukštį pasibaigus, medis tebeauga į skersmenį, suformuodamas vėlyvąja medieną; kuo ankstesnė augimo pabaiga tuo daugiau formuojama kietesnės vėlyvosios medienos. Perkelti į pietus, šiauriniai genotipai sustoja augti į H anksčiau, todėl priaugina < minkštos ankstyvos medienos ir > vėlyvos (kietos) medienos.

3.3.7 Kandidatinių genų paieška
Tikslas sumažinti atstumą tarp žymenų ir QTL bei identifikuoti QTL genus. Kandidatiniai genai tai sekvenuoti genai, kurie gali įtakoti požymio išraišką (t.y. genai sąlygojantys tikslius biocheminių procesus, pvz. enzimas kanalizuojantis lignino monomerų jungtis). Potencialūs kandidatiniai genai gali būti identifikuojami panaudojant žinomus QTL žymenis ir specifinių audinių cDNR bibliotekas bei naudojant tinkamas cDNR sekas kaip geno žymenis: įprastinėse QTL analizėse, geno efektui nustatyti. alternatyvių alelių sąsajų su požymiais tyrimus klonų archyvuose ar kitose polimorfinėse populiacijose= pagrindinių genų (t.y. genų, kurių polimorfizmas turi esminę įtaką fenotipui) paieška. A candidate gene is associated with variation in a trait and believed to be involved with the development or physiology of the trait. Association studies: Based on linkage disequilibrium between a phenotype and DNA polymorphisms. Goal: To identify genes responsible for phenotypic variation in traits of interest Methodology Choose candidate genes based on biological system (physiology, biochemistry) and/or QTL information Amplify part or all of the gene using consensus or degenerate primers Identify polymorphisms in the candidate genes or flanking sequence (length, DNA sequence, restriction sites) Scale up genotyping using allele specific primers or sequencing Identify and genotype a population Analyze association between allele (haplotype) and phenotype Validate Software - Buckler lab Advantages: Complementary to QTL analysis Within population statistical power =>F2 Can be used with many different kinds of populations Modest cost - sequencing, primers, polymerase, DNA extraction SNPs and Indels provide an inexhaustable supply of polymorphic markers Adaptable to breeding program Disadvantages: Requires apriori knowledge of genes and a putative function Population structure may result in false positives Non-trait genes may influence target trait making it difficult to select candidates Difficult to narrow down candidates from 100s to a few with high linkage disequilibrium Proof of gene identity difficult due to variation in closely linked genes Can be complicated by pleiotropy and gene interactions Based on linkage disequilibrium Long Term Goal - Rapid, large-scale gene discovery and characterization QTL localization "Functional Markers" Understand DNA sequence/protein/phenotype relationship for quantitative trait variation Identify gene targets for crop improvement

Pagrindiniai paieškos principai
1. Kandidatinius genus žyminčių žymenų kūrimas: genų ekspresijos tyrimas  polimorfinių cDNR identifikacija  sekų nustatymas  atitikmenų paieška bibliotekose  geną žyminčių žymenų kūrimas (EST ar STS) Polimorfinių cDNR nusatymas cDNR atitinkančių genų paieška bibliotekose Specifinės sekos žyminčios abi geno puses naudojamos kaip žymenys Sekvenavimas cDNR GTATAGGTCTCTGT Kandidatinio geno seka 2. Kandidatinius genus žyminčių žymenų naudojimas geno ir požymio sąsajai patikrinti ir polimorfinių geno formų (alelių identifikacijai) QTL Žymenų naudojimas geno patikrinimui (geno sąsajos su fenotipiniu požymiu patikrinimas) ir polimorfizmo studijos Alternatyvios vieno geno formos (aleliai) galai skirtis tik keliais nukleotidais: identifikavus QTL žinoma tik viena iš šio geno formų kelių populiacijų ir keliolikos šeimų bandymai

Klonų archyvas: alelių “kasykla”
Klonų archyvai (genotipų kopijų kolekcijos) ir tolimų populiacijų bandymai gali tarnauti kaip puiki medžiaga įvairių žinomo geno formų alelių identifikacijai. Kadangi šiuose bandymuos sukaupta nemaža dalis rūšiai atstovaujančios genetinės įvairovės. Žinant geno sekas (ar jo dalies sekas iš EST bibliotekų) šie archyvai gali būti naudojami kaip alternatyvių šio geno formų (alelių) “kasyklos” Pinus sylvestris klonų archyvas Alternatyvios vieno geno formos gali skirtis nedideliu sekų skaičiumi Skirtingų klonų DNR molekulės su poligenais printed

SNP žymenų taikymas (1) SNP ir juos žyminčios specifinės gretimos DNR nukleotidų atkarpos randamos: a) sekvenuojant polimorfinius PCR fragmentus, pagausintus naudojant EST žymenis polimorfinėse populiacijose (kilmės, klonų archyvai) b) analizuojant cDNR sekų duomenų bazėse esančias genų sekas (vadinami eSNP). Paprastai SNP randamas kas nukleotidų. Žinant SNP vietą žyminčias DNR atkarpų sekas, tolesnis SNP taikymas ženklai palengvėja naudojant DNR mirko sekas ar PCR ir automatinio sekvenavimą. Išreikšto geno dalis (cDNR dalis) CTCAGACA GAGTCTGT EST žymenys (PCR pradai) identifikuojantys geną PCR pagausimas ir sekvenavimas GAGTCTGT CTCAGACA Polimorfinės populiacijos genotipų analizė ir SNP atradimas QTL Toliau SNP identifikuojami pagal tam pagamintus žymenis (specifines DNR sekas abiejose SNP šonuose) ir naudojami geno polimorfizmo paieškoje GAGTATGT Vieno nukleotido pokytis SNP žymuo CTCATACA Genotipas A SNP žymuo CTCAGACA GAGTCTGT Vieno nukleotido pokytis Genotipas B SNP žymuo

Polimorfinės populiacijos pavyzdys: Pinus sylvestris klonų archyvas
SNP žymenų taikymas (2) 1. SNP žymenų naudojimas geno (cDNR) polimorfizmo nustatymui polimorfinėje populiacijoje. Polimorfinės populiacijos pavyzdys: Pinus sylvestris klonų archyvas SNP žymenys Išreikštų skirtingų fenotipų atranka polimorfinėje populiacijoje (klonų archyvas ar tolimų populiacijų bandymas) 2. PCR produktų sekvenavimas ir SNP polimorfizmo nustatymas Ypač efektyvus metodas svarių genų (major genes) identifikavai (t.y. genų kurių polimorfizmas turi esminę įtaką fenotipinio požymio išraiškai); būtent svarių genų nustatymas naudingas selekcijai. Elektroforezės gelis Sekvenatorius Bakterijos Fragmentai izoliuojami iš gelio ir terpiami į bakterijų plazmides (saugojimui) ir sekvenuojami taip nustatant SNP polimorfizmą, kuris lyginamas su fenotipu. Alternatyviai naudojama hibridizacija su žinomų genų cDNR DNR mirko gardelėse

Miško medžių klonų archyvai
Miško medžių klonų archyvai tai sistematikiškai išdėstyti genotipų kopijų želdinai, skirti vertingų genų išsaugojimui Du skirtingo šakojimosi tipo klonai paprastosios eglės klonių archyve (genus žymintis požymis – šakojimosi tipas) (Šlėnava) Poskiepis ir įskiepis genetiškai skirtingi ir pradega augimą skirtingu laiku: genus žymintis požymis pumpurų sprogimo laikas

3.3.8 QTL naudojimas selekcijoje
Molekulinių žymenų, patikimai susijusių su tam tikrais požymiais, naudojimas atrenkant individus vadinamas atranka žymenų pagalba (ang. marker assisted selection (MAS)). Pavyzdys: reikia atrinkti kietos medienos genotipus jauname amžiuje Lauko bandymas: kuris iš jaunų medelių turės kietą medieną? Laboratorinių DNR tyrimų rezultatas: elektroforezės gelis A B C C B QTL žymuo naudojamas laboratorinėse analizėse, kurių rezultate nustatomi požymiui specifiniai DNR fragmentai A

MAS nauda selekcijoje Pavyzdys: medžių aukštis, sąlygojamas 4 genų, kurių reikšmė išreikšta skaitine verte; požymio vertes įtakoja aplinka taip suformuodama fenotipą Reali padėtis: žinomos genų vertės, genotipas, aplinka ir fenotipas Matoma vertinant: žymenų sąsajos su QTL ir fenotipo matavimo duomenys QTL QTL 2 4 1 4 16 -6 +7 +4 13 17 7 A 1 1 1 4 7 +6 +5 -5 13 14 7 1 1 2 5 Genotipas Aplinka 9 Fenotipas B 1 1 2 5 Genotipas Aplinka 9 Fenotipas 3 1 3 15 15 C 1 1 3 9 12 Paveiksle lyginamas 3 medžių A, B, ir C aukštis, tikslu parodyti molekulinių žymenų naudą pasirenkant tinkamus individus. Poligenų bendros reikšmės sudaro genotipo reikšmę, kuri yra veikiama aplinkos sąlygų ir sudaro fenotipo reikšmes (fenotipas tai išoriniai matoma požymio išraiška). Svariausią įtaką turintis genas (vadinamas QTL) yra vienas iš kelių poligenų, sąlygojančių tam tikrą požymį. Įprastiniuose selekciniuose bandymuose nėra informacijos apie tikrą genotipą, o atranka atliekama vertinant fenotipus ir naudojant informaciją apie jam giminingų fenotipų pranašumą, apskaičiuojant jų genotipo vertės prognozuojančias selekcines vertes. Paveiksle kairėje parodyta reali padėtis: poligenų vertės, genotipo vertė, aplinkos sąlygų įtaka ir galutinė fenotipo vertė (reali padėtis miško medžių selekcijoje yra nežinoma). Dešinėje parodytas atvejis, kai naudojantis su QTL susijusiu žymeniu, galima identifikuoti QTL palikuonyse. Jeigu nebūtų naudojamasi molekulinių žymenų informacija, atranka pagal fenotipą būtų atlikta su paklaida. Nors ir sąlygodamas tik tam tikrą dalį požymio vertės, QTL ženkliai padidintų teigiamų genų identifikacijos tikimybę. Jei QTL genas turi labai svarią įtaką požymio išraiškai, jį galima efektyviai panaudoti selekcijoje, bandant surasti su QTL susėjusius molekulinis žymenis, kurių buvimą palikuonyse būtų nesunku nustatyti. Poligenai Informacija apie žymenų sąsają su QTL ženkliai padidintų atrankos efektyvumą (padėtų identifikuoti pranašius individus).

MAS efektyvumas Tam, kad nustatyti QTL ir panaudojimo galimybės tam tikroje selekcinėje populiacijoje, galima kryžminti QTL nustatymui naudotą šeimą su visos selekcinės populiacijos narių žiedadulkių miškiniu ir sekti QTL žymens rekombinacijos dėsningumus palikuonyse QTL panaudojimas efektyviausias žemo paveldimumo požymiams arba požymiams kurių nustatymui riekia daug laiko (reprodukciniai požymiai, medienos kokybė) Jei žinomi dviejų požymių žymenys, efektyvu juos panaudoti nustatant kurie iš palikuonių paveldėjo abu požymius kontroliniuose kryžminimuose Rastam QTL suteikiamas svorinis indeksas pagal procentą paaiškinto tikslinio požymio kintamumo.

Literatūros sąrašas Bahrman N, Damerval C (1989) Linkage relationships of loci controlling protein amounts in maritime pine (Pinus pinaster Ait.). Heredity 63: Binelli G, Bucci G (1994) A genetic linkage map of Picea abies Karts., based on RAPD markers, as a tool in population genetics. Theor Appl Genet 88: Benfey, P Essentials of Genomics. Prentice Hall ISBN: Cato, S.A, Gardenr, R.C., Kent, UJ., Richardson T.E A rapid PCR-based method for genetically mapping ESTs. Theoretical and Applied Genetics 102: Carlson JE, Tulsieram LK, Glaubitz JC, Luk VWK, Kauffeld C, Rutledge R (1991) Segregation of random amplified DNA markers in F1 progeny of conifers. Theor Appl Genet 83: Devey ME, Bell JC, Smith DN, Neale DB, Moran GF (1996) A genetic map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD and microsatellite markers. Theor Appl Genet 92: Devey ME, Fiddler TA, Liu BH, Knapp SJ, Neale BD (1994) An RFLP linkage map for loblolly pine based on a three-generation outbred pedigree. Theor Appl Genet 88: Falconer, D.S. and Mackay, T. F.C Introduction to Quantitative Genetics (4th Edition). Prentice Hall, ISBN: FAO, Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification. Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy. Grattapaglia D, Sederoff R (1994) Genetic linkage maps of Eucalyptus grandis and E. urophylla using a pseudo-testcross mapping strategy and RAPD markers. Genetics 137: Grattapagia, D.F., Bertolucci, R., Pencher, R., Sederoff, R Genetic mapping of QTLs controlling growth and wood quality traits of Eucalyptus grandis using a materal half sib family and RAPD markers. Genetics 144: Harry DE, Neale DB (1994) PCR-based genetic markers for loblolly pine developed from cloned cDNAs. The International Conference on the Plant Genome II, january. San Diego, CA poster # 76 Hutchison K, Singer P, Volkaert H, Deker A, Costello L, Greenwood M (1994) A PCR-based molecular genetic map for the conifer Larix decidua. The International Conference on the Plant Genome II, january. San Diego, CA poster # 90

Kumar, S. and Fladung, M Molecular Genetics and Breeding of Forest Trees. Food Products Press, ISBN: Krutovskii, K.V., Neale, D. B. Forest genomics for conserving adaptive genetic diversity. Forest Genetic Resource Working Paper FGR/3(E), FAO, Rome Italy. Liu, B.-H Statistical Genomics: linkage, mapping and QTL analysis. CRC Press, New Yourk. Lehner A, Campbell MA, Wheeler NC, Pöykkö T, Glössl J, Kreike J, Neale DB (1995) Identification of a RAPD marker linked to the pendula gene in Norway spruce (Picea abies (L.) Karst. f. pendula). Theor Appl Genet 91: Mei-Ling Ting Lee Analysis of Microarray Gene Expression Data. ISBN: Springer. Michelmore R, Paran I, Kesseli RV (1991) Identification of marker linked to disease resistance gene by bulk segregant analysis : a rapid mathod to detect markers in specific genomic regions using segregating populations. Proc Natl Acad Sci USA 88: Paran I, Michelmore RW (1993) Development of reliable PCR-based markers linked to downy resistance genes in lettuce. Theor Appl Genet 85: Paterson, A. H Molecular Dissection of Complex Traits. CRC-Press; 1 edition ISBN: Paterson, A. H Molecular Dissection of Quantitave traits: Progress and Prospects. Genome Research 3: Plomion C, Bahrman N, Durel C-E, O'Malley DM (1995a) Genomic mapping in Pinus pinaster (Maritime pine) using RAPD and protein markers. Heredity 74: Sewell, M.M, Neatle, D Mapping quasntitative trait sin forest trees. In: Molecular biology of woody plants. Forestry Sciences, Vol. 64 (S.M. Jain and S.C. Minocha eds.) pp Sliesaravičius, A ir Stanys, V Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius, ISBN Smith DN, Devey ME (1994) Occurrence and inheritance of microsatellites in Pinus radiata. Genome 37: Wakamiya I, Newton RJ, Johnston JS, Price HJ (1993) Genome size and environmental factors in the genus Pinus. Am J Bot 80: Wilcox PL (1995) Genetic dissection of fusiform rust resistance in loblolly pine. Ph D thesis, North Carolina State University, 125p Verhaegen, D.C., Plomion, J-M., Gion, M. Kremer, A Quantitative trait dissection analysis in Eucalyptus using RAPD markers. Theor. Applied Genetics 95: Yazdani R, Yeh F, Rimsha J (1995) Genomic mapping of Pinus sylvestris (L.) using random amplified polymorphic DNA markers. For Genet 2:

3.3 Kiekybinių požymių lokusų (QTL) identifikavimas

Similar presentations

Presentation on theme: "3.3 Kiekybinių požymių lokusų (QTL) identifikavimas"— Presentation transcript:

Similar presentations

About project

Feedback

Log in

Auth with social network:

3.3 Kiekybinių požymių lokusų (QTL) identifikavimas

Similar presentations

Presentation on theme: "3.3 Kiekybinių požymių lokusų (QTL) identifikavimas"— Presentation transcript:

Similar presentations

About project

Feedback