1. Cell culture models in the study of drug efflux transporters
Mgr. Martina Čečková
Department of Pharmacology and Toxicology Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové

2. Cell culture models Primary cultures Cell lines immortalized cells
cancer cell lines
Genetically modified cell lines
Cell cultures as a model of biological barriers
Použití buněčných modelů
– etické výhody (minimalizace časově, finančně a experimentálně náročných pokusů na zvířatech)
- možnost použití lidských buněk (model lidské tkáně)
- rychlá metoda (pro studium transepiteliální permeability látek a molekulárních mechanizmů transportu léčiv)
Primární kultury – buňky izolované z tkáně živého organizmu (smíšená populace buněčných typů) přeneseny do živného média
Buněčné linie – vznik pasážováním primárních kultur, z kmenových bb, buněčné linie imortalizované virovými nebo buněčnými onkogeny, nádorové buněčné linie
Kultivace jako bb suspenzní nebo adhezivní
Geneticky modifikované buněč. linie – vnesen gen pro expresi studovaného transportéru – vhodné pro studium funkce a substrátové specifity transportérů, a identifikaci (screening) látek, které s ním interagují
Pro studium farmakokinetických procesů (Absorpce, distribuce, eliminace léčiv), na kterých se mohou podílet lékové transportéry – použití buněčných modelů biologických bariér

3. GENETICALLY MODIFIED CELLS
MDCKII-parent
 MDCKII-MDR1
 MDCKII-BCRP
 MDCKII-MRP2
MEF 3.8-parent
 MEF 3.8-BCRP
Transport assays
Accumulation / efflux assays
ATPase assays
MDCK – imortalizovaná buněčná linie odvozená z buněk proximálního tubulu ledvin kokršpaněla, v současnosti nejlépe charakterizovaný epiteliální buněčný model
Výhoda – krátká kultivační doba, snadná manipulace, vytvářejí polarizovanou monovrstvu s adhezivními a těsnými spoji – vhodné pro transportní studie
- Máme k dispozici geneticky modifikované MDCK linie obsahující gen pro expresi MDR1 (= P-glykoprotein), BCRP a MRP2 transportérů
MEF3.8 myší fibroblasty - bez endogenní exprese MDR1 (nízký background pro studium transportérů)
Základní metody pro studium funkce a substrátové specifity transportérů
Transportní studie – buňky kultivovány na semipermeabilních membránách, sledován transport přes vytvořenou monovrstvu
Akumulační studie – vhodné i pro buňky suspenzní
ATPasové studie – nepřímo sledovaná funkce aktivních transportérů , nízká citlivost

4. TRANSPORT ASSAYS
Transportní studie – umožňují sledovat kinetiku transportu, lokalizaci transportéru v rámci buňky
Polarizované buňky, apikální membrána (strana in vivo obrácená do lumen) – vrchní kompartment, Basolaterální membrána obrácená k membráně (in vivo k pod ní uloženým tkáním) – spodní kompartment
Semipermeabilní m
Rozdíl v transportu u MDCK buněk a u buněk, které exprimují ve zvýšené míře studovaný transportér
Např. MCDK-BCRP – zvýšený eflux topotekanu (svého substrátu) v basolaterálně-apikálním směru

5. Transepithelial transport of PhiP
Pavek P., et al: 2005; J Pharmacol Exp Ther, 312(1):

6. ACCUMULATION EXPERIMENTS

7. Interactions between BCRP and antiepileptics
Accumulation of BODIPY- prazosin in MEF3.8-BCRP cells
Cerveny L., et al., 2005

8. CELL CULTURES AS A MODEL OF BIOLOGICAL BARRIERS
Intestine:
Caco-2,
HCT-8, HT-29, SW-480…
Kidney:
HK-2
Liver:
Cultured hepatocytes
HepG2
Blood-brain barrier:
BCEC
SV-HCEC, HBEC-51, BB19
Blood-testis barrier:
isolated Sertoli cells
Placenta:
BeWo, JEG3, JAR

9. PLACENTA
in vitro model of human trophoblast – cell line BeWo
BeWo

10. Expression of BCRP in BeWo cell line
Number of transcripts per microgram of total RNA (Real time RT-PCR)
Transcript (104)
Human term placenta
BeWo
Mean ± S.D.
Minimum-Maximum
BCRP
104.4 ± 16.2
626.7
MDR1
8.9 ± 2.5
N.D.
Immunodetection of BCRP (Western blotting, BXP-21 antibody)
A - MDCKII
B - MDCKII – BCRP
C – BeWo
D – human term placenta
Ceckova M., et al., Clin Exp Pharmacol Physiol, 2005

11. Localization of BCRP in the BeWo cells
Indirect immunofluorescence microscopy (BXP-21 antibody)
BCRP transporter is localized predominantly in the apical plasma membrane
Ceckova M., et al., Clin Exp Pharmacol Physiol, 2005

12. Functional expression of BCRP in BeWo cells
Accumulation assay  FACS analysis
Substrate: 20µM mitoxantrone
Inhibitors: GF120918, Ko143, PSC833
BCRP actively pumps mitoxantrone out of BeWo cells
Ceckova M., et al., Clin Exp Pharmacol Physiol, 2005

13. BCRP BCRP pumps potentially toxic xenobiotics from trophoblast cells
in feto-maternal direction
BCRP
BeWo

14. Poděkování Department of Pharmacology and Toxicology
Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove
Doc. PharmDr. František Štaud, Ph.D.
PharmDr. Petr Pávek, Ph.D.
Mgr. Lukáš Červený
Mgr. Antonín Libra
Prof. MUDr. Zdeněk Fendrich, CSc.
Department of Pathophysiology, Medical University of Vienna
Univ. Prof. DI Dr. Renate Fuchs
Dr. Marianne Brabec
Institute of Clinical Immunology and Alergology, Faculty Hospital, Hradec Kralove
PharmDr. Doris Vokurková