1. به نام پروردگار

2. یادآوری گروه بندی و انتخاب موضوع تحقیق؟ –نحوه ارایه : پاورپوینت - تحقیق در چند صفحه همراه منابع تعریف بیوتکنولوژی –مثالهایی از بیوتکنولوژی کلاسیک –بیوتکنولوژی مدرن کلونینگ چیست؟ تراریخت چیست؟ انسان شبیه سازی شده؟

3. بیوتکنولوژی جلسه دوم PCR

4. واكنش زنجيره ‌ اي پلي ‌ مراز Polymerase chain reaction

7. Leading Strand Laging Strand 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Single strand binding proteins DNA Polymerase Okazaki fragment RNA Primers Primase 5’ 3’ 5’ Helicase همانند سازی DNA

8. آنزیم های کلیدی در همانند سازی DNA DNA Polymerase DNA Ligase Primase Helicase Topoisomerase Single strand binding protein

9. PCR چیست؟ روشی که در آن قسمت خاصی از DNA الگو توسط آنزیم پلیمراز در سیکلهای گرمایی تکثیر می گردد جایگزین روش کلونینگ ژن در باکتری : –ساده تر –کم هزینه تر –سریعتر

10. تاریخچه 1985 كری موليس 1993 برنده نوبل

11. دلایل پیشرفت این روش DNA پلیمراز مقاوم به حرارت دستگاههای ترمال سایکلر

12. مواد مورد نیاز آب دیونیزه پلیمراز ((Taq نوکلئوتید (dNTPs) پرایمرها بافر آنزیم کوفاکتور (Mg) الگو (DNA)

13. مراحل واکنش PCR دناتوراسیون اولیه مراحلی که چندین سیکل تکرار می شوند –دناتوراسیون –اتصال پرایمرها –طویل شدن طویل شدن نهایی

14. Overview of PCR 1.Temperature Cycling Denaturation 94° Annealing 55° Extension 72° 2. Every cycle DNA between primers is duplicated

18. PCR Amplification

19. Exponential Amplification

20. PCR Melting 94 o C Temperature 100 0 50 T i m e 5’3’ 5’

21. PCR Melting 94 o C Temperature 100 0 50 T i m e 3’5’ 3’ Heat

22. PCR Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperature 100 0 50 T i m e 3’5’ 3’ 5’ Melting 94 o C

23. PCR Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperature 100 0 50 T i m e 30x 3’5’ 3’ Heat 5’

24. PCR Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperature 100 0 50 T i m e 30x 3’5’ 3’ 5’

25. PCR Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperature 100 0 50 T i m e 30x 3’5’ 3’ 5’ Heat

26. PCR Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperature 100 0 50 T i m e 30x 3’5’ 3’ 5’

27. Fragments of defined length PCR Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperature 100 0 50 T i m e 30x 3’5’ 3’ 5’

28. Plateau phase Linear phase Exponential phase End point analysis on agarose gels Cycles PCR Product Polymerase Chain Reaction

29. الکتروفورز

30. عوامل موثر در PCR Reagent and instrument User mistakes Template Primers

31. برخی کاربردها تشخیص بیماری ژنتیکی تعیین هویت افراد تشخیص بیماری ویروسی تیتر ویروسی توسط Real-Time PCR تکثیر قطعه خاص ژنی برای ژن کلونینگ ایجاد جهش برای ژن کلونینگ اضافه کردن قطعات خاص برای ژن کلونینگ بررسی بیان ژن RT-PCR

32. مقدمه ای بر Real Time PCR

34. What’s Wrong With Agarose Gels? * Low sensitivity * Non-automated * Size-based discrimination only * Results are not expressed as numbers * Ethidium bromide staining is not very quantitative

35. Three general methods for the quantitative detection: 1-TaqMan, Beacons, Scorpions 2. Hybridisation probes 3. DNA-binding agents (SYBR Green) The first two methods are specific formats.

37. Fluoresces when bound to dsDNA

40. DNA Polymerase 5' exonuclease activity

41. Polymerization 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Forward Primer Reverse Primer TaqMan ® Probe R Q Taqman probes are “hydrolysis” probes

42. Displacement 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Forward Primer Reverse Primer R Q

43. Hydrolysis 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Q R

44. Polymerization Completed 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ R Q

45. FRET Emission P Excitation Amplicon Hybridization probes

46. Denaturation 95 o C

47. FRET Emission P Excitation TmTm 55 o C Primer/Probe Annealing Fluorimeter Reading Fluorimeter Reading

48. 72 o C Primer Extension

49. Molecular Beacons

50. Scorpion

51. Product confirmation

52. Melting curve analysis

53. Melting peaks

56. SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS threshold Ct

59. Real-Time PCR Applications Quantification of DNA and RNA Identify of presence and copy number of sequence – Identification and quantification of pathogen – Diagnosis of disease condition Quantitation of Gene Expression Array Verification

60. Real-time PCR advantages * amplification can be monitored real-time * no post-PCR processing of products (high throughput, low contamination risk) * ultra-rapid cycling (30 minutes to 2 hours) * requirement of 1000-fold less RNA than conventional assays (3 picogram = one genome equivalent) * detection is capable down to a 2-fold change * confirmation of specific amplification by melting point analysis * most specific, sensitive and reproducible * not much more expensive than conventional PCR (except equipment cost)

61. Real-time PCR disadvantages * not ideal for multiplexing * setting up requires high technical skill and support * high equipment cost * * * * DNA contamination (in mRNA analysis)

62. موفق باشین